鹽度對(duì)蝦油中蛋白酶系的影響范文

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《現(xiàn)代食品科技雜志》2014年第七期

1材料與方法

1.1原料南美白對(duì)蝦（PenaeusvannameiBoone）的蝦頭蝦殼，由陽(yáng)江市海達(dá)速凍水產(chǎn)有限公司提供，凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2研究方法

1.2.1蝦油發(fā)酵將蝦頭蝦殼絞碎，加入原料重的5%的食鹽混勻，于45℃水浴中自溶（以80r/min震蕩）。4h后用紗布過(guò)濾得自溶液，測(cè)定自溶液的鹽度，并補(bǔ)充食鹽，分別將自溶液鹽度調(diào)節(jié)至16%、20%和24%。于35℃保溫發(fā)酵，定期測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，測(cè)定前補(bǔ)加蒸發(fā)掉的水分使鹽度保持恒定。

1.2.2理化指標(biāo)測(cè)定pH值：以PB-10pH計(jì)測(cè)定；酸度：參照GB5413.34-2010，采用NaOH滴定法，當(dāng)?shù)味ㄖ羛H為8.3時(shí)，計(jì)算產(chǎn)品酸度；可溶性固形物：以BK8280糖度計(jì)測(cè)定，無(wú)鹽可溶性固形物含量為蝦油離心后所測(cè)得的可溶性固形物糖度減去產(chǎn)品相應(yīng)鹽度產(chǎn)生的糖度；氨基酸態(tài)氮（AAN）：參照GB18186-2000中的甲醛滴定法測(cè)定。揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）和三甲胺（TMA）：采用康微皿法測(cè)定[11]。

1.2.3菌落總數(shù)按GB/T4789.2-2003方法稍作改進(jìn)，耐鹽細(xì)菌和不耐鹽細(xì)菌分別用含10%鹽度和0%鹽度的PCA培養(yǎng)基計(jì)數(shù)。耐鹽真菌和不耐鹽真菌分別用含10%鹽度和0%鹽度的PDA培養(yǎng)基計(jì)數(shù)。

1.2.4蛋白酶活力的測(cè)定參照SB/T10317-1999的方法測(cè)定。在40℃下10min水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸定義為1個(gè)活力單位（U）。

1.2.5蛋白酶酶譜電泳樣品處理：取15mL蝦油，8000r/min離心10min，上清轉(zhuǎn)移至截留分子量為14000Da的透析袋中透析6h。透析完畢后用分子量為20000Da的聚乙二醇覆蓋在透析袋外面吸水至透析液體積到1~2mL，將透析液全部轉(zhuǎn)移至2mL離心管中，并用雙蒸水定容至2mL。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（NativePAGE）和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移：制作電泳膠（分離膠10%，濃縮膠5%），使上述預(yù)處理的樣品在預(yù)冷藏的NativePAGE緩沖液（pH8.3Tris-Gly）中電泳以防因電壓過(guò)高導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。調(diào)節(jié)濃縮膠電壓為80V，分離膠電壓為100V。電泳完畢后剝膠。提前制作好含0.25%酪蛋白的蛋白酶檢測(cè)膠（30%凝膠儲(chǔ)液2mL，2.5%的酪蛋白1mL，0.05mol/LTris-HCl（pH8.8）2.5mL，ddH2O4.5mL，TEMED10μL，10%AP100μL）。依次在半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)移裝置的負(fù)極板上鋪上濾紙，電泳膠，檢測(cè)膠，再鋪上濾紙，并驅(qū)除氣泡，蓋上正極板，以40mA電流轉(zhuǎn)移40min，取出檢測(cè)膠，于37℃孵育40min，以使酪蛋白充分水解。然后以考馬斯亮藍(lán)染色30min后于搖床上震蕩脫色過(guò)夜。檢測(cè)膠上的透明條帶即為蛋白酶水解帶。

1.2.6游離氨基酸的測(cè)定參照GB/T5009.124-2003的方法，采用日立-8800型氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)。色譜柱：日立855-350型；反應(yīng)柱溫：134℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：570nm和440nm；流速：0.35mL/min。標(biāo)準(zhǔn)氨基酸為Sigma產(chǎn)品。

1.2.7感官評(píng)定方法與標(biāo)準(zhǔn)采用定量描述分析法（QDA）進(jìn)行感官評(píng)定。5個(gè)人為一小組，分四個(gè)小組，分別對(duì)樣品的顏色、奶酪味、肉味、氨味、醬香味、腥味、腐臭味進(jìn)行評(píng)價(jià)。感官評(píng)定成員進(jìn)行兩周，總時(shí)間不小于2h的培訓(xùn)。

1.3數(shù)據(jù)分析所有理化指標(biāo)進(jìn)行三次平行測(cè)定，采用SPSSStatistics19軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)表達(dá)成平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差。p<0.05認(rèn)為具有顯著差異。

2結(jié)果與討論

2.1鹽度對(duì)蝦油無(wú)鹽可溶性固形物和AAN的影響圖1中，16%鹽度的蝦油在發(fā)酵第10d已明顯腐敗，所以未繼續(xù)測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。其他鹽度發(fā)酵的蝦油在發(fā)酵初期20d內(nèi)無(wú)鹽可溶性固形物及AAN含量迅速上升，后期相對(duì)平穩(wěn)。無(wú)鹽可溶性固形物為蝦油離心后所測(cè)得的糖度減去蝦油所含食鹽所產(chǎn)生的糖度，可反映蝦油可溶性蛋白的趨勢(shì)。鹽度越高，無(wú)鹽可溶性固形物和AAN含量越小，這表明高鹽度會(huì)抑制蛋白酶活力，使可溶性蛋白或多肽的生成減少，從而導(dǎo)致游離氨基酸減少。經(jīng)SPSS軟件方差分析可知，鹽度對(duì)樣品的無(wú)鹽可溶性固形物和AAN含量影響非常顯著（p<0.01）。

2.2鹽度對(duì)蝦油pH和酸度的影響圖2顯示，蝦頭蝦殼自溶液pH在8.0左右，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，蝦油pH逐漸減小，酸度緩慢增加，發(fā)酵30d后蝦油pH和酸度逐漸穩(wěn)定在7.5~8.0范圍內(nèi)，且鹽度越大，pH及酸度變化幅度越小，推測(cè)上述變化與蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生游離氨基酸和肽有關(guān)。經(jīng)SPSS軟件方差分析可知，鹽度對(duì)樣品pH和酸度影響顯著（p<0.05）。

2.3鹽度對(duì)蝦油TVB-N和TMA的影響圖3顯示，蝦油的TVB-N和TMA的含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化相似，在發(fā)酵前期20d內(nèi)快速增加，以后漸趨平穩(wěn)；且鹽度越高TVB-N和TMA的含量越低，16%鹽度的蝦油發(fā)酵至第10d時(shí)，TVB-N和TMA含量已分別劇增至0.61mg/mL和0.09mg/mL，而20%和24%鹽度的蝦油TVB-N和TMA含量一直分別保持在0.45mg/mL和0.04mg/mL以下。TVB-N和TMA分別由細(xì)菌等微生物分解氨基酸、氧化三甲胺等物質(zhì)產(chǎn)生，鹽度越高對(duì)細(xì)菌等微生物的抑制作用越強(qiáng)；同時(shí)圖1顯示高鹽度時(shí)游離氨基酸的生成減少，細(xì)菌分解的底物減少，這些原因都會(huì)導(dǎo)致TVB-N和TMA含量降低。經(jīng)SPSS軟件方差分析可知，鹽度對(duì)蝦油TVB-N和TMA含量影響非常顯著（p<0.01）。

2.4鹽度對(duì)蝦油中微生物的影響圖4顯示，發(fā)酵初期10d內(nèi)耐鹽細(xì)菌的數(shù)量小于不耐鹽細(xì)菌，10d后耐鹽細(xì)菌快速增加，超過(guò)不耐鹽細(xì)菌成為優(yōu)勢(shì)菌。還可發(fā)現(xiàn)20%鹽度的蝦油中耐鹽細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)高于24%鹽度的蝦油。經(jīng)SPSS軟件方差分析可知，鹽度對(duì)蝦油的耐鹽細(xì)菌和不耐鹽細(xì)菌的數(shù)量影響非常顯著（p<0.01）。表1顯示，蝦頭蝦殼自溶液中耐鹽和不耐鹽真菌都很少，約103cfu/mL，在發(fā)酵過(guò)程中，真菌的數(shù)量降至30cfu/mL以下，在很多樣品中甚至檢測(cè)不到。這說(shuō)明在蝦油發(fā)酵過(guò)程中真菌幾乎不起作用。黃紫燕等[12]研究發(fā)現(xiàn)魚(yú)露的中嗜鹽酵母菌為優(yōu)勢(shì)菌，這與本研究的結(jié)果不同，推測(cè)這種差異與原料差異有關(guān)，因魚(yú)露發(fā)酵過(guò)程中pH一般保持在4.5~6.0；而本研究的蝦油在發(fā)酵過(guò)程中pH一直在7.5~8.0范圍內(nèi)，一般來(lái)說(shuō)，略偏酸性的環(huán)境有利于真菌的生長(zhǎng)繁殖。

2.5鹽度對(duì)蝦油蛋白酶活力和組成的影響圖5鹽度對(duì)蝦油蛋白酶活力的影響Fig.5Influenceofsalinityonproteaseactivityduringfermentationofshrimpsauce蝦油總蛋白酶包括蝦油內(nèi)源蛋白酶和微生物產(chǎn)的外源蛋白酶。發(fā)酵10d內(nèi)，總蛋白酶活力下降，10d后總蛋白酶活力上升，在發(fā)酵30d后趨于平衡。這種變化與圖4中細(xì)菌數(shù)量的變化趨勢(shì)相似，推測(cè)是發(fā)酵初期10d內(nèi)，蝦油中部分內(nèi)源蛋白酶在高鹽度下逐漸失活，同時(shí)細(xì)菌數(shù)量很少且呈下降趨勢(shì)，導(dǎo)致的發(fā)酵10d內(nèi)總蛋白酶活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。10d后細(xì)菌數(shù)量明顯增加，產(chǎn)生了新的蛋白酶，使總蛋白酶活力明顯上升。圖5顯示鹽度越高蛋白酶活力越低，說(shuō)明高鹽度會(huì)抑制蛋白酶活力，Klomklao等[13]對(duì)魚(yú)露的研究也得出相似結(jié)論。經(jīng)SPSS軟件方差分析可知，鹽度對(duì)蛋白酶活力影響非常顯著（p<0.01）。圖6是各種鹽度發(fā)酵的蝦油在不同時(shí)期的蛋白酶電泳圖譜，從譜帶亮度可知蛋白酶活力大小為20%鹽度>24%鹽度，這與圖5中蛋白酶活力測(cè)定的結(jié)果一致。蝦油內(nèi)源蛋白酶（蝦頭蝦殼自溶液中的蛋白酶）有4種（1、2、3和4號(hào)），2、3、4號(hào)蛋白酶活力逐漸減小，只有1號(hào)蛋白酶活力沒(méi)有明顯下降，這也解釋了圖5中，蝦油在發(fā)酵10d內(nèi)蛋白酶活力逐漸減小的現(xiàn)象。隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，蝦油中逐漸出現(xiàn)了自溶液中原本沒(méi)有的蛋白酶，發(fā)酵第5d時(shí)產(chǎn)生了新的蛋白酶（5、6、7、8號(hào)），第60d出現(xiàn)了新的蛋白酶（9和10號(hào)），這說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程中的微生物產(chǎn)生了蛋白酶。由于表2顯示真菌幾乎不起作用，所以新的蛋白酶很可能是圖4顯示的，發(fā)酵10d后迅速增加的耐鹽細(xì)菌產(chǎn)生的。綜上可知，蝦油發(fā)酵過(guò)程中內(nèi)源蛋白酶和細(xì)菌蛋白酶交替作用，細(xì)菌蛋白酶對(duì)發(fā)酵的貢獻(xiàn)不可忽視。

2.6鹽度對(duì)蝦油游離氨基酸組成的影響由表2知，蝦油游離氨基酸種類豐富，尤其富含天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸等甜味和鮮味氨基酸。20%鹽度和24%鹽度的蝦油甜味，甜味，鮮味和苦味氨基酸所占比例相當(dāng)。但20%鹽度的蝦油中鳥(niǎo)氨酸、氨基乙醇、胱硫醚和氨等臭味和氨味等物質(zhì)占比均高于24%鹽度的蝦油，且圖3顯示20%的蝦油TVB-N和TMA含量也高于24%鹽度放入蝦油，這說(shuō)明20%鹽度時(shí)尚有微弱的腐敗作用發(fā)生，導(dǎo)致蝦油中產(chǎn)生一些不良風(fēng)味成分。

2.7鹽度對(duì)蝦油感官評(píng)定的影響由表3的感官評(píng)定知，16%鹽度不能有效抑制腐敗，因此不適合發(fā)酵蝦油；20%以上鹽度才能有效抑制腐敗。20%鹽度發(fā)酵90d的蝦油醬香味和奶酪味較淡，夾雜著腥臭味和較濃的氨味；24%鹽度發(fā)酵的蝦油香氣濃郁，醬香味突出，肉味和鮮味明顯，酸臭味和腥味等不良風(fēng)味較淡，且表2顯示的其鮮味，甜味和苦味呈味氨基酸比例協(xié)調(diào)，綜合風(fēng)味較20%鹽度蝦油好。

3結(jié)論

本論文研究表明，蝦油發(fā)酵的鹽度需達(dá)到20%以上，否則將發(fā)生腐敗，但鹽度越高蛋白酶活力降低明顯，游離氨基酸的生成速度降低，綜合考慮防腐、風(fēng)味形成等因素，24%鹽度是發(fā)酵蝦油的最佳鹽度。蝦油發(fā)酵過(guò)程中內(nèi)源蛋白酶活力逐漸降低，細(xì)菌蛋白酶活力逐漸增加，并發(fā)揮重要作用；真菌對(duì)蝦油的發(fā)酵基本不起作用。

作者：段杉胡小喜廖廣強(qiáng)吳永和鄺浩斌楊柳李婷周幸芝單位：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院