針葉樹根腐病的研究進(jìn)展范文

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《生物技術(shù)通報(bào)雜志》2014年第七期

1大伏革菌介紹

大伏革菌隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、傘菌綱（Agaricomycetes）、多孔菌目（Polyporales）、原毛平革菌科（Phanerochaetaceae），是一種常見的木材腐朽菌。在自然環(huán)境中，大伏革菌子實(shí)體通常生長(zhǎng)在樹樁和倒木上，其生長(zhǎng)對(duì)濕度的要求較高。一般情況下，被侵染樹樁在1年后開始出現(xiàn)子實(shí)體，3-4年后子實(shí)體成熟［22］。成熟的子實(shí)體開始產(chǎn)生擔(dān)孢子，擔(dān)孢子是侵染樹木的主要形態(tài)，它能夠被廣泛的傳播，在距離產(chǎn)孢中心250m遠(yuǎn)的地方均有擔(dān)孢子出現(xiàn)。擔(dān)孢子大多在晚上釋放，影響其形成速率的主要因素有溫度和空氣濕度等。另外，大伏革菌經(jīng)過菌絲斷裂過程可以產(chǎn)生無性孢子，無性孢子也可以侵染樹樁，但到目前為止，關(guān)于無性孢子傳播方式的研究較少。大伏革菌菌株有同核體和異核體之分，同核體是指在菌絲體中細(xì)胞核的基因型相同，它是由基因型相同的菌絲融合而成；異核體是指帶有不同遺傳性狀的兩個(gè)單倍體菌絲相互融合，導(dǎo)致菌絲體中并存有兩種或以上不同遺傳型的核。大伏革菌同核體和異核體菌株之間在形態(tài)上無明顯區(qū)別，但在性質(zhì)上有較大差異，特別是在防治病原菌方面，同核體菌株的孢子產(chǎn)量比異核體菌株大得多，但只能在室內(nèi)實(shí)驗(yàn)室條件下防治異擔(dān)子菌，其生長(zhǎng)速率和防治效率均比異核體菌株小，在林地中易退化［23，24］，故在防治異擔(dān)子菌中沒有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。因此，目前無論進(jìn)行室內(nèi)研究還是生產(chǎn)商業(yè)制劑均采用異核體菌株。

2大伏革菌防病歷史及商業(yè)化菌劑發(fā)展

1950年，英國人Rishbeth［20］首先提出用大伏革菌防治異擔(dān)子菌，大伏革菌可以像異擔(dān)子菌一樣侵染樹木活組織，通過優(yōu)先占領(lǐng)生態(tài)位來控制異擔(dān)子菌在該樹樁上的生長(zhǎng)，其侵染過程不依靠其他微生物的輔助作用。大伏革菌在自然狀態(tài)下侵染松樹的概率很高，這樣可以保護(hù)松樹免受異擔(dān)子菌侵染。在英國，大伏革菌侵染樹樁概率和侵染面積均比異擔(dān)子菌高，但兩者侵染樹樁的季節(jié)不一樣，大伏革菌孢子對(duì)于干燥的環(huán)境更敏感，在溫暖且極其干燥的情況下，大伏革菌產(chǎn)孢率降低，與異擔(dān)子菌間競(jìng)爭(zhēng)減弱，導(dǎo)致異擔(dān)子菌大范圍侵染樹樁。在芬蘭，大伏革菌和異擔(dān)子菌孢子出現(xiàn)的時(shí)間大致相同，在5月末到8月末大伏革菌孢子出現(xiàn)概率最大，此時(shí)可以顯著降低異擔(dān)子菌的侵染率。Meredith［25］通過試驗(yàn)證明，大伏革菌孢子即使比異擔(dān)子菌孢子沉降低，也可以降低異擔(dān)子菌侵染面積。最初應(yīng)用大伏革菌作為生防劑時(shí)，在接種量和應(yīng)用劑型方面還難以把握。1963年，Rishbeth［22］制作了片狀的生防劑，用以溶解稀釋后噴灑于伐樁表面。試驗(yàn)得出在20℃條件下，溶解稀釋后的孢子懸浮液在48h后孢子活力沒有顯著降低，但實(shí)際應(yīng)用中建議現(xiàn)用現(xiàn)配。此劑型主要缺點(diǎn)是在森林中使用時(shí)至少要提前1h水化，實(shí)際常常需要通宵浸泡。1968年，Rishbeth優(yōu)化了生防劑型，以乳化油替代了片劑應(yīng)用于森林中［9］，但乳化油較易污染，很難維持無菌狀態(tài)。1970年，產(chǎn)品被重新包裝，新的包裝形式是將孢子懸浮液混合于蔗糖溶液中，將此混合物密封于聚氯乙烯小袋中，此商品克服了過去出現(xiàn)的問題，且保存時(shí)間長(zhǎng)。因此，英國人將該混合物發(fā)展為商業(yè)化菌劑，商品注冊(cè)名為“PGS”［26］。PGS只能施用于松樹上，在4℃條件下保存7個(gè)月。此后，多個(gè)國家（如保加利亞、加拿大、芬蘭、法國、德國和波蘭等）將此商品應(yīng)用于林地進(jìn)行野外防治，取得了較好效果。與此同時(shí)，各國科學(xué)家們都在研究適合自己國家的生物防治菌劑。1970年，波蘭商業(yè)化的生防菌劑產(chǎn)生，注冊(cè)名為“IBL”。此商品是將大伏革菌的孢子和菌絲接種于滅菌后的山毛櫸木屑中，將此混合物放于聚乙烯的小袋中，可應(yīng)用于松樹和云杉上，在干燥低溫環(huán)境下可存放1年。1991年，芬蘭科學(xué)家從云杉樹樁上分離得到一株異核體大伏革菌，將其做成可濕性粉劑，混合硅膠后，密閉封存在箔襯袋中，此商品注冊(cè)名為“Rotstop”，其可應(yīng)用于松樹和云杉上，在零下18℃條件下可存放18個(gè)月；8℃下存放1年；室溫下可存放1星期。但打開包裝后必須在24h內(nèi)使用［26］。與此同時(shí)，美國也生產(chǎn)了大伏革菌商品化制劑，但是未獲得認(rèn)可。在Fennos-candia地區(qū)，每年有62000hm2的歐洲云杉使用大伏革菌來防治異擔(dān)子菌；在整個(gè)歐洲，每年有超過20萬棵樹木使用此方法來進(jìn)行根腐病的防治［27，28］。中國對(duì)針葉樹干基腐朽病的防治研究較少。作者于2012年在中國東北林區(qū)及云南省廣泛采集和分離野生大伏革菌，并且通過室內(nèi)培養(yǎng)基及木樁實(shí)驗(yàn)，對(duì)比了我國的和國外引進(jìn)的野生大伏革菌對(duì)中國小孔異擔(dān)子菌的防治效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中國大伏革菌防治小孔異擔(dān)子菌的效率較國外大伏革菌差。

3大伏革菌防病機(jī)制

早期研究表明，大伏革菌抗異擔(dān)子菌的機(jī)制可能有3種：菌絲干涉、營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)和誘導(dǎo)寄主抗性。

3.1菌絲干涉菌絲干涉是在真菌競(jìng)爭(zhēng)間普遍存在的一種現(xiàn)象，大伏革菌能夠引起異擔(dān)子菌菌絲結(jié)構(gòu)及功能變化，在一定程度上造成異擔(dān)子菌死亡。它們之間的菌絲干涉模式和Ascoboluscrenulatus與Coprinusheptemerus之間干涉模式相似，即在兩者接觸區(qū)域，質(zhì)膜內(nèi)陷，形成超大的質(zhì)膜囊泡，細(xì)胞里的內(nèi)含物通過此囊泡外泄，細(xì)胞逐漸瓦解、死亡，而且在兩者接觸區(qū)域無可見的線粒體，連結(jié)線粒體的電子致密物質(zhì)沉積［29，30］。Mgbeahuruike等［31］在2013年指出，大伏革菌培養(yǎng)過程中分泌的微小粒子能夠抑制異擔(dān)子菌早期葡萄糖代謝過程的關(guān)鍵酶表達(dá)。同時(shí)，由于大伏革菌的干涉作用，兩種菌絲交互作用中異擔(dān)子菌編碼信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的關(guān)鍵蛋白的基因表達(dá)水平降低，使其競(jìng)爭(zhēng)力減弱。

3.2營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)大伏革菌作為營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)者，通常和病原菌之間競(jìng)爭(zhēng)碳、氮和鐵等營(yíng)養(yǎng)元素，進(jìn)而限制其增長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)鍵在于其能夠快速的在樹樁上定殖，占領(lǐng)更多的生態(tài)位，致使異擔(dān)子菌不能夠繼續(xù)侵染樹樁。Käärik和Rennerfelt［32］在1957年證實(shí)大伏革菌比異擔(dān)子菌能更快的侵染樹樁，也能在已被病原菌侵染的樹樁上代替異擔(dān)子菌。這和大伏革菌胞外酶的分泌有必然聯(lián)系，因?yàn)榇蠓锞鳛橐环N常見的木材腐朽菌，能夠產(chǎn)生許多胞外酶，這些酶可以降解木材組織，利用降解產(chǎn)物來滿足自身對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求，同時(shí)達(dá)到定殖于樹木上的目的。一般情況下，不同大伏革菌菌株產(chǎn)生某種酶的酶活性不一樣，酶活越高，定殖樹木的速率就越大，生物防治的潛能也就越大。大伏革菌產(chǎn)生的胞外酶有：脫氫酶、磷酸酶、纖維素酶、漆酶和通用過氧化物酶等。Anna等［33］在2008年指出，大伏革菌產(chǎn)生的漆酶較少，過氧物酶、纖維素酶、磷酸酶和脫氫酶含量高。漆酶主要參與木質(zhì)素氧化和殺菌的酚類物質(zhì)降解和脫毒過程，大伏革菌缺少漆酶就說明大伏革菌不是致病菌。另外，大伏革菌產(chǎn)生P2O酶，該酶參與到木質(zhì)纖維素的氧化解聚中，主要作用方式是給過氧化物酶（木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶）提供H2O2［34］。一般情況下，呼吸酶的活性（如脫氫酶和磷酸酶）可以作為真菌降解過程強(qiáng)弱的量度，磷酸酶的活性受脫氫酶的影響。2000年，Varela和Martinez［35］在大伏革菌中發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素過氧化物酶，大伏革菌高的過氧化物酶活性象征著樹木木質(zhì)素生物降解的開始，這對(duì)于白腐菌是必要的過程。

3.3誘導(dǎo)寄主抗性施用大伏革菌能使寄主細(xì)胞產(chǎn)生有毒的代謝物質(zhì)，這些代謝物質(zhì)限制了異擔(dān)子菌進(jìn)一步生長(zhǎng)。在植物生命活動(dòng)中，細(xì)胞程序化死亡對(duì)于植物正常生理活動(dòng)是很重要的，而在這一過程中半胱氨酸起著重要的調(diào)解作用。研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)處理大伏革菌后，調(diào)節(jié)半胱氨酸蛋白酶產(chǎn)生及壞死細(xì)胞死亡的基因高度轉(zhuǎn)錄［36，37］，寄主部分細(xì)胞程序化死亡，從而使由異擔(dān)子菌侵染引起的寄主組織壞死斑停止繼續(xù)擴(kuò)展［38］。最重要的是，施用腐生營(yíng)養(yǎng)型大伏革菌后能夠提高寄主的局部抗性，使寄主細(xì)胞壁木質(zhì)化和栓化，強(qiáng)度增加，阻止了異擔(dān)子菌的侵染定殖。在大伏革菌預(yù)處理過的組織中，DAHPS和SAMS兩個(gè)基因高度轉(zhuǎn)錄，DAHPS基因可產(chǎn)生合成木質(zhì)素過程中第一個(gè)酶［39］，而SAMA基因則編碼不同木質(zhì)素衍生物合成過程中的關(guān)鍵酶［40］。木質(zhì)素及其衍生物的合成，能夠阻止病原菌產(chǎn)生的酶和毒素的滲透和擴(kuò)散，從而保護(hù)樹木組織。因此，這兩個(gè)基因的高度轉(zhuǎn)錄說明了它們?cè)谧柚巩悡?dān)子菌侵入的過程中的起著關(guān)鍵作用。

4大伏革菌防病過程對(duì)周圍環(huán)境的生態(tài)影響

在森林生態(tài)系統(tǒng)中，根際周圍存在著很多生物，如細(xì)菌、菌根真菌和昆蟲等，這些生物中有的能起到保護(hù)樹木的作用，它們通過營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)等手段來對(duì)抗木材腐朽菌。細(xì)菌在整個(gè)樹木腐朽過程中非常重要，如固氮細(xì)菌對(duì)腐朽過程中氮平衡的維持起到重要作用［41］。與化學(xué)防治相比，生物防治是一種環(huán)境友好的防治方法，其對(duì)靶標(biāo)生物影響較小。然而，大規(guī)模的應(yīng)用生物防治劑會(huì)不可避免地對(duì)針葉樹樹樁上的真菌、細(xì)菌群落及地表植被造成很大的影響［42-46］。使用Rotstop處理初期，大伏革菌在樹樁上占主導(dǎo)地位，這并不影響其他微生物定殖樹樁。但是，由于大伏革菌生長(zhǎng)速率較快，限制了其他微生物的營(yíng)養(yǎng)利用，以致可減少達(dá)15%的物種豐富度。處理6年后，大伏革菌漸漸失去主導(dǎo)地位，而Resiniciumbicolor、Hypholomacapnoides和Sistotremabrinkmannii等真菌逐漸增多［46］。在意大利，施用大伏革菌2年就會(huì)對(duì)該地區(qū)真菌區(qū)系造成很大影響［47］。另外，有研究表明大伏革菌的生長(zhǎng)能夠顯著降低腐朽初期階段細(xì)菌的豐富度［43］。而應(yīng)用單一基因型的Rotstop生物制劑在短時(shí)間內(nèi)不會(huì)對(duì)當(dāng)?shù)卮蠓锞N群基因型造成威脅［48］。

5野生大伏革菌篩選過程、指標(biāo)及防病注意事項(xiàng)

商業(yè)化生物制劑所用菌株均是從野外采集、分離，純化，最后通過一定的試驗(yàn)驗(yàn)證而得到的防治效果最好的菌株。Rotstop制劑所用菌株是同一種異核體菌株，PGS所用菌株是從野外采集選取的近10種菌株，而IBL選取的菌株則更多。這3種商業(yè)化制劑選取的野生大伏革菌菌株均是從野外的腐朽樹樁、原木或裸露的木片上采集和分離的。采集工作是一個(gè)持續(xù)的過程，我們必須不斷更新和補(bǔ)充菌株，篩選效果最好的菌株來防治異擔(dān)子菌。篩選可用于商業(yè)化的高效大伏革菌沒有固定的程序，總體來說分為3個(gè)方面。（1）在MEA培養(yǎng)基上測(cè)量大伏革菌生長(zhǎng)速率和拮抗異擔(dān)子菌效率。實(shí)際工作中，IBL在MEA中添加了愈創(chuàng)木酚，測(cè)量其酚氧化酶活性；Rotstop在MEA中添加了木質(zhì)素染料，測(cè)量其分解木質(zhì)素的活性，這些對(duì)于篩選高效菌株都是必需的。（2）室內(nèi)測(cè)量木樁上大伏革菌防治異擔(dān)子菌效率。其中，IBL選擇測(cè)量被異擔(dān)子菌侵染后木片失重率和預(yù)處理大伏革菌然后接種異擔(dān)子菌木片失重率，失重率測(cè)量同樣適用于室內(nèi)木樁篩選生防菌。（3）在野外伐樁上測(cè)量前面篩選過的高效大伏革菌防治異擔(dān)子菌效率。PGS和IBL在松樹上進(jìn)行，Rotstop在云杉上進(jìn)行，經(jīng)過野外伐樁防治效率的檢驗(yàn)，最終確定商品化的菌株。2011年，Anthony［23］改良了室內(nèi)篩選菌株的培養(yǎng)基，他所用的木鋸屑改良培養(yǎng)基是和自然介質(zhì)最接近且最適合大伏革菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，可以用于快速篩選高生長(zhǎng)率和拮抗作用的大伏革菌，而室內(nèi)樹樁篩選關(guān)鍵看其在樹木上的生長(zhǎng)速率。他在2012年指出，大伏革菌的兩個(gè)疏水蛋白Pgh1和Pgh2在其防治異擔(dān)子菌中發(fā)揮重要作用，強(qiáng)拮抗作用菌株在木鋸屑培養(yǎng)基的單菌落中Pgh1高度表達(dá)，拮抗能力和兩菌株接觸時(shí)Pgh1、Pgh2的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)［49］。所以，在篩選高效菌株時(shí)，也可以從基因水平入手，這樣使結(jié)果更為準(zhǔn)確。作者在前人研究的基礎(chǔ)上，從別人很少研究的酶活角度入手，研究大伏革菌纖維素酶活力與其木樁拮抗率的關(guān)系，試驗(yàn)得出，兩者在0.01水平上顯著相關(guān)。纖維素酶能夠降解新鮮樹樁及其根部組織細(xì)胞壁纖維素結(jié)構(gòu)，使真菌能夠快速定殖于樹樁，這是高效生防菌株所必須的，故作者認(rèn)為可以將大伏革菌胞外纖維素酶活作為高效生防菌株篩選的指標(biāo)之一。另外，在篩選過程中還發(fā)現(xiàn)大伏革菌的控制效率和其孢子懸浮液的濃度、異擔(dān)子菌的孢子懸浮液濃度以及這兩個(gè)菌株孢子比例密切相關(guān)［50］。1960年，Meredith［25］發(fā)現(xiàn)防治松樹根腐病所需的異擔(dān)子菌和大伏革菌孢子懸浮液濃度比例是1/10時(shí)最有效，但在防治挪威云杉時(shí)，比例為1/2.5，每種寄主要求的比例不一樣。而且防治效率和噴灑的大伏革菌孢子懸浮液的面積成一定數(shù)量關(guān)系，大伏革菌噴灑面積越大，異擔(dān)子菌侵染樹樁面積越小［51］。Dumas［52］在2011年得出，一些化學(xué)物質(zhì)，如木質(zhì)素磺酸銨（木銨，ALS）能夠刺激大伏革菌的萌發(fā)和生長(zhǎng)，當(dāng)大伏革菌孢子溶解于1%或2.5%的木銨溶液時(shí)，大伏革菌在任何溫度下的萌發(fā)率均比溶解于水中高，且其萌發(fā)管更長(zhǎng)，將此懸浮液噴灑于伐樁表面時(shí)，大伏革菌能夠更快定殖于伐樁表面，進(jìn)而防止異擔(dān)子菌侵染伐樁。大伏革菌是一種有兩極雜交系統(tǒng)的異核體真菌，通過配對(duì)實(shí)驗(yàn)和DNA印跡分析得出，歐洲的大伏革菌菌株之間是互交可育的，而且其歐洲種群和北美洲種群間也是互交可育的。因此，也可以通過優(yōu)良菌種雜交來達(dá)到提高大伏革菌防治效率的目的［24］。

6結(jié)語

大伏革菌菌株作為防治針葉樹根腐病的有效菌株已經(jīng)被廣泛使用。但隨著野外防治時(shí)間增加，大伏革菌優(yōu)良基因退化，且病原菌形成一定的抗性。此時(shí)，使用新的篩選方案對(duì)于大伏革菌的廣泛應(yīng)用具有一定的好處。隨著分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及基因組學(xué)等相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，我們可以將研究目光聚焦在與大伏革菌自身拮抗能力相關(guān)的基因及拮抗異擔(dān)子菌過程中相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化上，利用分子育種技術(shù)培育高效大伏革菌。

作者：李杏春何雙輝單位：北京林業(yè)大學(xué)微生物研究所