交替氧化酶在麻瘋樹(shù)鹽脅迫中的作用范文

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《生物技術(shù)通報(bào)雜志》2014年第七期

1材料與方法

1.1材料

供試麻瘋樹(shù)（JatrophacurcasL.）種子源自四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生理與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（林宏輝教授惠贈(zèng)）。

1.2方法

1.2.1鹽脅迫處理播種前麻瘋樹(shù)種子用0.1mol/LKMnO4溶液浸泡種子5min進(jìn)行消毒，并用清水浸泡12h，然后沙層催芽。種子萌發(fā)后選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗以每盆1顆移入含營(yíng)養(yǎng)土和蛭石（1∶1）的培養(yǎng)基質(zhì)上種植，同時(shí)每天施以1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，兩真葉期幼苗用于鹽脅迫試驗(yàn)。鹽脅迫處理時(shí)，先用200mmol/L、400mmol/L和1mol/LNaCl水溶液進(jìn)行土壤灌澆，然后將整個(gè)花盆苗置于含200mmol/L、400mmol/L和1mol/LNaCl水溶液的托盤中培養(yǎng)，每天上、下午對(duì)托盤中的鹽溶液進(jìn)行更換；對(duì)照組幼苗用去離子水處理。實(shí)時(shí)記錄不同處理組幼苗的生長(zhǎng)變化情況。

1.2.2AOX基因的RT-PCR擴(kuò)增分析麻瘋樹(shù)葉片總RNA的提取參照林莎等［21］的方法進(jìn)行。不同處理組RNA濃度經(jīng)紫外分光光度計(jì)（TU-1800）檢測(cè)后，取1μg總RNA，用FirstStrandcDNAsythesisKit（Fermentas公司），反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。AOX基因RT-PCR擴(kuò)增引物參照NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列（NCBI登錄號(hào)：GW876353.1）進(jìn)行設(shè)計(jì)，上游引物：5''''-CGATGGCTCTTTCACCTT-3''''；下游引物：5''''-CGCAATAGTTTCCAGCAC-3''''。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，采用Quantityone4.62軟件（Bio-Rad公司）進(jìn)行半定量分析。

1.2.3呼吸測(cè)定麻瘋樹(shù)葉片呼吸測(cè)定參照Xu等［10］的方法用Clark型氧電極（Hansatech，King’sLynn，UK）進(jìn)行總呼吸，細(xì)胞色素途徑呼吸和抗氰呼吸的測(cè)定和計(jì)算。無(wú)呼吸抑制劑時(shí)測(cè)得總呼吸速率；同時(shí)加入細(xì)胞色素途徑抑制劑KCN（氰化鉀，終濃度為1mmol/L）和交替途徑抑制劑n-PG（沒(méi)食子酸丙酯，終濃度為100μmol/L）測(cè)得剩余呼吸速率；僅加入KCN時(shí)的呼吸速率減去剩余呼吸速率為交替途徑呼吸速率。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

1.2.4葉綠素含量的測(cè)定葉綠素含量的測(cè)定參照Xu等［10］的方法進(jìn)行。

1.2.5含水量測(cè)定取約1g麻瘋樹(shù)幼苗葉片，用電子天平稱重，記錄為Wf。將稱重后的葉片裝入兩個(gè)潔凈培養(yǎng)皿中，在120℃烘箱中干燥處理約50min。取出稱重后，再放回烘箱，之后間隔約10min稱重一次，直至恒重，記錄為WD．

1.2.6丙二醛和過(guò)氧化氫含量測(cè)定丙二醛（MDA）含量和過(guò)氧化氫（H2O2）含量的測(cè)定參照Wang等［22］的方法進(jìn)行。

1.2.7氣孔觀測(cè)分別撕取對(duì)照組和鹽脅迫條件下的麻瘋樹(shù)幼苗葉片，制作葉表皮臨時(shí)裝片。氣孔用兩滴KI-I2染色后，置顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.8數(shù)據(jù)分析所有的數(shù)值都重復(fù)測(cè)定3次，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差（standarddeviation，SD）。采用GraphpadPrism6.0軟件分析數(shù)值的變化。以最小顯著差異值（leastsignificantdifference，LSD）0.05判斷各種結(jié)果差異是否顯著。

2結(jié)果

2.1不同濃度鹽脅迫對(duì)麻瘋樹(shù)生長(zhǎng)的影響如圖1-A所示，麻瘋樹(shù)幼苗在200mmol/L和400mmol/LNaCl脅迫條件下生長(zhǎng)良好，且當(dāng)鹽濃度提高到1mol/LNaCl處理時(shí)，麻瘋樹(shù)仍未表現(xiàn)出明顯的脅迫損傷，表明麻瘋樹(shù)具有較強(qiáng)的耐鹽適應(yīng)能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，3種濃度鹽脅迫處理3d后，麻瘋樹(shù)葉片葉綠素含量與對(duì)照組相比無(wú)顯著差別。此外，鹽脅迫處理對(duì)葉片含水量的影響也不明顯，處理組和未處理組麻瘋樹(shù)葉片含水量均在90%左右，表明麻瘋樹(shù)在鹽脅迫條件下具有較強(qiáng)的光系統(tǒng)保護(hù)能力和調(diào)節(jié)水分平衡的機(jī)制。3種濃度鹽脅迫處理3d后，葉片過(guò)氧化氫（H2O2）含量與鹽脅迫處理濃度呈正相關(guān)，但與對(duì)照組幼苗相比并無(wú)顯著差別。同樣，丙二醛（MDA）含量也隨著脅迫處理所用鹽濃度的上升而增加，但不同處理組之間沒(méi)有明顯差異，與對(duì)照組的差異也不顯著（圖1）。這些結(jié)果表明，麻瘋樹(shù)具有較強(qiáng)的鹽脅迫適應(yīng)機(jī)制。但是，高濃度鹽（1mol/LNaCl）脅迫處理?xiàng)l件下，麻瘋樹(shù)幼苗的生長(zhǎng)速率變緩。1mol/LNaCl處理麻瘋樹(shù)幼苗10d后，葉片面積明顯小于未處理的對(duì)照組（表1）。

2.2鹽脅迫對(duì)AOX呼吸和AOX基因表達(dá)的影響AOX途徑已被證實(shí)在植物逆境脅迫響應(yīng)中扮演著減輕脅迫損傷、穩(wěn)定植物生長(zhǎng)速率和增加植物抵御能力的作用，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了鹽脅迫處理對(duì)AOX呼吸和AOX基因表達(dá)的影響。圖2-A顯示，鹽脅迫條件下，麻瘋樹(shù)葉片總呼吸被不同程度抑制。與對(duì)照組幼苗相比，400mmol/L和1mol/LNaCl處理組葉片總呼吸下降最為明顯，但在處理后第2天趨于穩(wěn)定。相反，AOX呼吸在鹽脅迫處理?xiàng)l件下被顯著誘導(dǎo)（圖2-B）。在正常生長(zhǎng)條件下，AOX呼吸約占總呼吸的28%。200mmol/LNaCl處理1d后，AOX呼吸約占總呼吸的40%。更明顯的是，400mmol/L和1mol/LNaCl處理1d后，AOX呼吸占總呼吸的比例超過(guò)了50%。此外，圖2-C顯示，鹽脅迫處理明顯誘導(dǎo)了AOX基因的轉(zhuǎn)錄。與對(duì)照組相比，200mmol/L和400mmol/LNaCl處理3d后，AOX基因的轉(zhuǎn)錄水平上升近兩倍。1mol/LNaCl處理后，AOX的轉(zhuǎn)錄水平上升近3倍。因此，AOX呼吸途徑的誘導(dǎo)表達(dá)可能是麻瘋樹(shù)具有耐鹽脅迫能力的原因之一。

2.3鹽脅迫處理后葉片氣孔比較分析為進(jìn)一步分析麻瘋樹(shù)的鹽脅迫反應(yīng)，本研究還檢測(cè)了鹽脅迫處理對(duì)氣孔開(kāi)合度的影響。結(jié)果（圖3）表明，200mmol/LNaCl處理時(shí)，麻瘋樹(shù)葉片氣孔大小與對(duì)照組幾乎相同。400mmol/LNaCl處理時(shí)，麻瘋樹(shù)葉片氣孔開(kāi)度明顯減小。當(dāng)鹽濃度提高到1mol/LNaCl處理時(shí)，麻瘋樹(shù)葉片氣孔大部分處于半閉合狀態(tài)。因此，麻瘋樹(shù)可能通過(guò)調(diào)節(jié)氣孔開(kāi)合度來(lái)維持葉片較高的含水量，這可能也是麻瘋樹(shù)具有較高耐鹽性的原因之一。

3討論

麻瘋樹(shù)耐貧瘠，生命力旺盛，根系強(qiáng)大，能在降水量少、環(huán)境惡劣的地區(qū)種植，但到目前為止麻瘋樹(shù)的抗逆機(jī)理仍不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)不同濃度鹽脅迫處理對(duì)麻瘋樹(shù)生長(zhǎng)的影響及交替氧化酶在鹽脅迫條件下的表達(dá)變化，以期進(jìn)一步揭示麻瘋樹(shù)對(duì)逆境脅迫的耐受機(jī)制。研究結(jié)果表明，麻瘋樹(shù)在200mmol/L、400mmol/L和1mol/LNaCl處理?xiàng)l件下均表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽適應(yīng)性。麻瘋樹(shù)幼苗在200mmol/L和400mmol/LNaCl處理?xiàng)l件下生長(zhǎng)狀況良好，長(zhǎng)勢(shì)幾乎與對(duì)照組相同。1mol/LNaCl處理減緩了麻瘋樹(shù)幼苗的生長(zhǎng)速率，但并沒(méi)有造成明顯的脅迫損傷。陳健妙等研究表明，100-150mmol/LNaCl處理對(duì)麻瘋樹(shù)幼苗的長(zhǎng)勢(shì)影響不大，且低濃度鹽處理（20-50mmol/LNaCl）還能促進(jìn)麻瘋樹(shù)幼苗的生長(zhǎng)和生物量的積累。本研究也發(fā)現(xiàn)，3種濃度鹽脅迫條件下，麻瘋樹(shù)幼苗葉片葉綠素、H2O2和丙二醛含量與對(duì)照組相比并無(wú)顯著差異。

此外，本研究表明麻瘋樹(shù)在鹽脅迫條件下具有較強(qiáng)的水分調(diào)節(jié)能力。試驗(yàn)期間，脅迫處理組和對(duì)照組麻瘋樹(shù)幼苗葉片細(xì)胞含水量均維持在一個(gè)較高的水平。據(jù)此，我們分析可能與調(diào)節(jié)氣孔開(kāi)合度有關(guān)，麻瘋樹(shù)幼苗在200mmol/LNaCl處理?xiàng)l件下葉片氣孔開(kāi)合度與對(duì)照組沒(méi)有太大差異，但用400mmol/LNaCl和1mol/LNaCl處理時(shí)，氣孔開(kāi)度明顯減小，尤其是在1mol/LNaCl處理?xiàng)l件下，氣孔大多處于半閉合狀態(tài)。前人的研究也表明麻瘋樹(shù)具有較強(qiáng)的抗?jié)B透脅迫能力。竇新永等曾報(bào)道麻瘋樹(shù)幼苗在高濃度的PEG（25%）處理15d后仍能存活，表明其具有對(duì)干旱缺水的環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性。陳友根等也曾報(bào)道，適度的滲透脅迫不會(huì)影響麻瘋樹(shù)的生長(zhǎng)，反而會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞葉綠素的合成。1mol/LNaCl處理的麻瘋樹(shù)幼苗葉片面積明顯小于對(duì)照組幼苗。葉面積的減少可降低相對(duì)蒸騰速率，從而減少水分散失；加上氣孔開(kāi)度的減小，麻瘋樹(shù)能較好地維持葉片的相對(duì)含水量。但是，高濃度鹽處理引起的葉片氣孔開(kāi)度的減小可能是植株生長(zhǎng)減緩、葉面積降低的主要原因。因此，鹽脅迫對(duì)麻瘋樹(shù)的作用是多方面的，麻瘋樹(shù)在抗鹽反應(yīng)過(guò)程中自身代謝反應(yīng)也受到了影響。

麻瘋樹(shù)對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)性還應(yīng)與AOX呼吸途徑有關(guān)。本研究顯示，3種濃度鹽脅迫處理?xiàng)l件下，葉片細(xì)胞總呼吸受到了不同程度的抑制，但AOX途徑呼吸和AOX基因轉(zhuǎn)錄水平明顯上升。高濃度鹽處理（400mmol/L和1mol/LNaCl）1d后，AOX呼吸占總呼吸的比例超過(guò)了50%。此外，200mmol/L和400mmol/LNaCl處理3d后，AOX基因的轉(zhuǎn)錄水平高出對(duì)照組幼苗近兩倍。當(dāng)用1mol/LNaCl處理3d后，AOX基因的轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照組上升近3倍。這些結(jié)果表明，鹽脅迫誘導(dǎo)AOX的表達(dá)可能是麻瘋樹(shù)對(duì)鹽脅迫高度適應(yīng)的另一原因。事實(shí)上，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的一系列研究表明AOX在鹽脅迫條件下扮演著至關(guān)重要的角色，且鹽脅迫誘導(dǎo)AOX基因表達(dá)已在擬南芥、煙草、黃瓜、番茄等諸多植物中得以證實(shí)。研究人員在這些植物的抗逆應(yīng)答研究中發(fā)現(xiàn)，AOX表達(dá)的上升有助于減少脅迫條件下活性氧（ROS）的積累，減輕氧化損傷，從而維持植物的正常代謝生長(zhǎng)。Xu等研究表明，脅迫條件下AOX表達(dá)上升還有助于減輕逆境脅迫對(duì)光系統(tǒng)的損傷，使植物保持正常的光合效率。由此可見(jiàn)，本試驗(yàn)中AOX基因表達(dá)的上升可能與減輕鹽脅迫引起的氧化損傷有關(guān)。此外，越來(lái)越多的研究把AOX當(dāng)作細(xì)胞氧化損傷的標(biāo)記基因，甚至視為植物的“存活因子”。例如，擬南芥植物過(guò)表達(dá)AOX基因能顯著增強(qiáng)植物在逆境條件下的存活率；相反，沉默或抑制AOX基因表達(dá)的植株在脅迫條件下表現(xiàn)出嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，逆境適應(yīng)性大大減弱。因此，麻瘋樹(shù)幼苗AOX呼吸途徑的上升在一定程度上彌補(bǔ)了鹽脅迫對(duì)細(xì)胞色素途徑呼吸的影響，穩(wěn)定了線粒體中正常的電子傳遞，從而減少脅迫引起的氧化損傷。本研究表明麻瘋樹(shù)具有較強(qiáng)的耐鹽適應(yīng)性，AOX基因也在麻瘋樹(shù)鹽脅迫應(yīng)答過(guò)程中受明顯的誘導(dǎo)表達(dá)。但是，交替氧化酶的誘導(dǎo)機(jī)制是什么，及與其它抗逆因子間存在怎樣的關(guān)系，尚需進(jìn)一步研究證明。此外，麻瘋樹(shù)在鹽脅迫條件下氣孔導(dǎo)度的調(diào)節(jié)機(jī)制是什么，是否與脫落酸（ABA）和乙烯等抗逆激素有關(guān)，加強(qiáng)相關(guān)的研究有助于進(jìn)一步闡明麻瘋樹(shù)的耐鹽機(jī)理。

4結(jié)論

研究了鹽脅迫處理對(duì)麻瘋樹(shù)生長(zhǎng)的影響及AOX在麻瘋樹(shù)鹽脅迫響應(yīng)中的作用。結(jié)果表明，麻瘋樹(shù)具有較強(qiáng)的耐鹽性，200mmol/L和400mmol/LNaCl處理對(duì)麻瘋樹(shù)幼苗生長(zhǎng)影響不大。1mol/LNaCl處理時(shí)麻瘋樹(shù)生長(zhǎng)減緩，氣孔開(kāi)度降低，但未表現(xiàn)出明顯的脅迫損傷。此外，AOX呼吸和AOX基因的轉(zhuǎn)錄水平在鹽脅迫條件下明顯上升，表明AOX可能在麻瘋樹(shù)鹽脅迫應(yīng)答過(guò)程中起重要作用。

作者：余璐璐吳陽(yáng)晨王靜靜 魏倩 徐飛單位：武漢生物工程學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院