食源性致病菌的多重PCR檢測范文

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《生物技術(shù)通報雜志》2014年第七期

1材料與方法

1.1材料

菌種名稱及編號，見表1。

1.2方法

1.2.1引物的設(shè)計與合成根據(jù)沙門菌的hilA基因、金黃色葡萄球菌的nuc基因和腸出血性大腸桿菌O157H7的rfbE基因，應(yīng)用PrimerPremier5.0分別設(shè)計如下3對特異性引物（表2），并送至生工生物（上海）有限公司合成。

1.2.2食源性致病菌的培養(yǎng)和基因組DNA的提取從保藏斜面中挑取合適的菌落置于LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24h后，再以140的比例轉(zhuǎn)接至新的LB培養(yǎng)液中37℃恒溫培養(yǎng)24h進(jìn)行活化。最后以140的比例移接至新的LB培養(yǎng)液中37℃恒溫振蕩培養(yǎng)2-4h，至菌液OD600為0.7-1.0，用細(xì)菌DNA提取試劑盒分別提取3種菌的DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3單重PCR反應(yīng)體系的建立單重PCR反應(yīng)體系（50μL）：Taq酶0.25μL，10×PCRBuffer5μL，dNTPMixture4μL，模板DNA溶液3μL，引物（20μmol/L）各1μL，加去離子水至50μL。PCR參數(shù)：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，50℃退火1min，72℃延伸2min，30個循環(huán)；72℃延伸7min。4℃保存。

1.2.4多重pcr反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化將以上3對引物進(jìn)行兩兩組合或三者混合，混合3種致病菌的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，驗證多重PCR反應(yīng)的特異性及引物之間的相互作用。調(diào)整反應(yīng)體系中的引物濃度和模板濃度等，優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)程序同1.2.3。

1.2.5人工模擬樣品的PCR檢測分別制備沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌O157H7和金黃色葡萄球菌的菌懸液，將3種培養(yǎng)液單獨接種鮮奶培養(yǎng)24h，或任意兩兩等量混合然后取少量接種到鮮奶中培養(yǎng)24h。對人工染菌的食品樣品先進(jìn)行增菌，而后用試劑盒提取致病菌基因組DNA進(jìn)行PCR檢測。以未染菌的食品作為陰性對照。

2結(jié)果

2.1菌種及靶點在NCBI的編號針對試驗所用的沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌O157H7、金黃色葡萄球菌這3個菌種，及篩選定出的靶基因，從NCBI網(wǎng)站上下載3種菌的基因組及其特異性靶點的序列。

2.2單重PCR反應(yīng)體系驗證結(jié)果分別使用3種食源性致病菌所特有的特異性引物進(jìn)行單重PCR反應(yīng)，均能擴(kuò)增出與預(yù)計大小相符的目的條帶（圖1），且無非特異性條帶和二聚體；腸出血性大腸桿菌O157H7的rfbE基因287bp；金黃色葡萄球菌的nuc基因354bp；沙門氏菌的hilA基因468bp；Marker和PCR產(chǎn)物的上樣量均為400ng。回收3個PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，并在線與NCBI數(shù)據(jù)庫中的相應(yīng)種的序列進(jìn)行比對，比對結(jié)果顯示序列同源性均在99%以上。

2.3PCR反應(yīng)特異性實驗將3種致病菌的基因組DNA等量混合為模板，分別用一對引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示腸出血性大腸桿菌O157H7引物只能擴(kuò)增出腸出血性大腸桿菌O157H7中287bp大小的條帶，沒有非特異性條帶和引物二聚體；金黃色葡萄球菌引物只能擴(kuò)增出金黃色葡萄球菌的354bp大小的條帶，無非特異性條帶和引物二聚體；同樣沙門氏菌引物也只能擴(kuò)增出沙門氏菌468bp大小的條帶，無其他非特異性條帶。這說明所設(shè)計的引物具有高度特異性。

2.4多重PCR反應(yīng)體系的建立分別將沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌O157H7、金黃色葡萄球菌的基因組DNA等量混合為模板，按優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果（圖2）顯示，雙重PCR反應(yīng)后在相應(yīng)大小位置處出現(xiàn)了兩條特異性條帶，三重PCR反應(yīng)后，在354、287和468bp處分別出現(xiàn)了明顯的特異性目的條帶，且無非特異性條帶和引物二聚體的形成，Marker和PCR產(chǎn)物的上樣量均為400ng。經(jīng)過多次試驗，確定多重PCR的反應(yīng)體系為：（50μL）：Taq酶0.25μL，10×PCRBuffer5μL，dNTPMixture4μL，模板DNA溶液3μL，引物（20μmol/l）各1μL，加去離子水至50μL。2.5人工模擬樣品的PCR檢測將沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌O157H7和金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)液單獨接種至鮮奶中或任意兩兩等量混合取少量接種至鮮奶中培養(yǎng)。經(jīng)增菌后提取致病菌基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果（圖3）顯示，未加致病菌的鮮奶不能檢測出特異性條帶，而接種相應(yīng)致病菌的鮮奶均能檢測出對應(yīng)的特異性目的條帶，Marker和PCR產(chǎn)物的上樣量均為400ng。以上結(jié)果說明本研究所建立的多重PCR檢測方法可應(yīng)用于食品中的腸出血性大腸桿菌O157H7、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌3種致病菌的檢測，且該方法均有較高的特異性。

3討論

在經(jīng)濟(jì)發(fā)展的現(xiàn)代，健康成為人們越來越關(guān)注的問題，食品的安全問題成為社會關(guān)注的焦點。PCR快速檢測技術(shù)因為其特異性強(qiáng)和靈敏度高，操作簡單，消耗時間和試劑少，現(xiàn)已用于肝炎、艾滋病、皰疹病毒感染診斷［16］，也成為了食源性致病菌的重要檢驗方法之一。在PCR檢測技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的多重PCR技術(shù)也廣泛地應(yīng)用于食品檢測方面。目前用于檢測沙門氏菌的靶基因的引物基因主要有invA、invB、invC、invD、invE、hilA、fimA、hns、spv和16SrRNA，血清群特異性引物基因rfb基因和血清型特異性引物基因fliC、fljB和via基因等［13］。目前用于檢測腸出血性大腸桿菌O157：H7時，主要的毒力基因有：編碼志賀毒素stx1和stx2基因、編碼與細(xì)菌黏附作用有關(guān)的蛋白eaeA基因、編碼溶血素hly基因［14］。目前，用于檢測金黃色葡萄球菌腸毒素SE的相關(guān)靶基因有sea、seb、sec、sed、see、seh、sei和sej基因［13］，以及編碼耐熱核酸酶基因nuc，編碼血漿凝固酶coa基因［15］。通過實驗，本研究所設(shè)計的沙門氏菌的引物hilA-f可有效擴(kuò)增出468bp的特異性基因片段，腸出血性大腸桿菌O157H7的引物rfbE-f可有效擴(kuò)增出287bp的特異性基因片段，金黃色葡萄球菌的引物nuc-f可有效擴(kuò)增出354bp的特異性基因片段，這3對引物可成功用于致病菌的多重PCR快速檢測，此前未見報道。在食品中人工添加3種致病菌沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌O157H7和金黃色葡萄球菌，利用本實驗所設(shè)計的3對引物可成功的進(jìn)行多重PCR的快速檢測。本研究所建立的PCR反應(yīng)系統(tǒng)具有較好的特異性，為食品中常見致病菌的檢測提供了一種快速、簡便、準(zhǔn)確的方法，具有重要的理論意義及實踐意義。同時多重PCR可以與其他技術(shù)相結(jié)合，如熒光定量PCR相結(jié)合，可提高檢測效率。或是與其他檢測方法相結(jié)合，如基因芯片、實時PCR等，可以創(chuàng)造一個更完整的體系。

4結(jié)論

本研究針對常見的3種食源性致病菌腸出血性大腸桿菌O157H7的rfbE基因、金黃色葡萄球菌的nuc基因及沙門氏菌的hilA基因，設(shè)計出相對應(yīng)的特異性引物，單重PCR結(jié)果顯示能擴(kuò)增出與預(yù)計大小一致的片段，沒有非特異性擴(kuò)增。使用設(shè)計的引物對人工感染的鮮奶進(jìn)行檢測，結(jié)果表明未加致病菌的鮮奶不能檢測出特異性條帶，而接種相應(yīng)致病菌的鮮奶均能檢測出對應(yīng)的特異性目的條帶。

作者：余倩黃夢娜單位：仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院