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《四川動物雜志》2016年第二期
摘要：
以3種細菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)為供試菌，測定了長足大竹象雄性附腺提取物的抑菌活性。結果表明：長足大竹象雄性附腺提取物對革蘭氏陽性菌如枯草芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌活性。不同濃度的粗提物對枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌抑菌影響均差異顯著，抑菌活性隨著雄性附腺粗提物濃度的增加而增強。附腺粗提物對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別為0.2mg•mL-1、0.4mg•mL-1。不同處理溫度對長足大竹象雄性附腺粗提物的抑菌作用有一定影響。
關鍵詞：
長足大竹象；雄性附腺；抑菌作用
長足大竹象Cyrtotrachelusbuqueti又名竹橫錐大象，屬昆蟲綱鞘翅目象甲科的昆蟲，國內主要分布于重慶、廣東、廣西等地。長足大竹象是竹林主要害蟲，國家林業局將它列為我國林業危險性有害生物之一(王維德等，2002)。由于昆蟲的生殖道直接與體內環境相連，是潛在的微生物通道，有時可能會消極地影響繁殖的成功率。據文獻報道，為了防止有害細菌或真菌的入侵，許多昆蟲的生殖系統中能產生抗菌肽，包括雄性附腺。將未交配的雌蟲與剛交配的黑腹果蠅的雌蟲生殖道作對比，發現后者被增加了3種抗菌蛋白，其中蛋白之一(28kDa)是雄性附腺的產物(Lung&Wolfner，1999)；這些蛋白在交配過程中比精子先轉入到雌蟲體內，使得交配后的雌蟲生殖道和卵都能抵抗細菌的侵染；在精子進入后，在雄蟲生殖道內的這些蛋白可以保護精子免受細菌的侵害(Lung&Wolfner，2001)。目前有關昆蟲雄性附腺抑菌的研究已經有了一些報道，研究對象主要集中在作為生物學模式物種的果蠅(Wolfner，2002；Ram&Wolfner，2007)。本研究首次對長足大竹象雄性附腺抑菌作用進行研究，為下一步的長足大竹象雄性附腺生理功能研究提供有價值的資料。
1材料與方法
1.1供試昆蟲2014年8月初，在樂山師范學院實驗竹林罩網，采集捕捉竹筍上剛出土長足大竹象成蟲，根據蟲的外形特征來判斷雌雄。隨機采集體型中等大小的雌、雄蟲各50頭，在溫度25℃、相對濕度75%、光周期16L:8D下以盆栽竹筍喂食在室內飼養，每2d更換1次竹筍，讓其自由交配；用紅外攝像系統實時監測其交配情況，雄蟲交配一旦結束，隨即采其附腺體或將雄蟲轉移至新飼養室繼續飼養。實驗分別采集剛出土，出土24h，交配后0h、2h、12h、24h、48h的雄蟲附腺進行內容物蛋白含量測定。
1.2主要儀器高壓蒸汽滅菌鍋(YX-18LM)、冷凍干燥箱(HDR-100HP)、恒溫水浴鍋、電子天平(BSS224S)、游標卡尺、841型遠紅外電子專用干燥箱、移液槍、冷凍高速離心機(TGL-20MB/TGL-20M)、紫外可見分光光度計(K1901)。大腸桿菌Escherichiacoli、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、金黃色葡萄球菌Staphyloccocusaureus以及其他分析純等均由樂山師范學院生命科學學院實驗室提供。
1.3試驗方法
1.3.1雄蟲附腺內容物樣品制備按照實驗設計要求，選取各采樣節點雄蟲7頭，在4℃昆蟲生理鹽水(NaCl6.8g，CaCl20.2g，KCl0.2g，MgCl2•6H2O0.2g，NaHCO30.15g，葡萄糖7.7g，ddH2O1000mL)中解剖雄蟲，取出完整的大小雄性附腺，放入500μL磷酸緩沖液(pH6.86)中冰浴勻漿。10000r/min離心10min，取上清液，沉淀再用少量緩沖液清洗，離心后，收集上清液，合并相同上清液為一管，定容至1mL，-20℃保存備用，用于抑菌活性測定。
1.3.2雄蟲附腺內容物樣品蛋白含量測定利用Bradford法(Bradford，1976)，建立牛血清白蛋白標準曲線，分別用移液槍加入不同時期適量樣品各自定容到1mL，加入5mL考馬斯亮藍G-250蛋白質試劑，充分混合，放置2min后以空白為對照，測定其吸光值595nm，并通過標準曲線查得各待測樣品中蛋白質的含量。最終確定雄蟲附腺內容物樣蛋白含量較高的時期。
1.3.3雄性附腺蛋白干粉的制備選擇蛋白含量較高時期的雄蟲將其附腺內容物樣品進行冷凍干燥，制成蛋白干粉，-70℃貯存。
1.3.4培養基及無菌平板的制備固體培養基及無菌平板的制作參照沈萍等(1999)的方法。
1.3.5菌種的活化及菌懸液制備取3支已滅菌的試管，每支試管倒入一定量(不超過試管的1/5)的培養基，制成斜面(斜面不超過試管的1/2)，取供試菌種1環劃線培養，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌37℃培養24h，空白對照用無菌蒸餾水配制，采用血細胞計數板法計數，使菌懸液濃度為5×106~5×107個/mL，備用。
1.3.6含菌平板的制備將上述各培養基滅菌后倒于培養皿內，每個培養皿約20mL。待培養基凝固后，用滅菌移液槍準確吸取上述各種菌懸液0.2mL注入培養皿內，再用滅過菌的涂布棒迅速將菌液涂抹均勻，制成指示含菌平板。
1.3.7抑菌性的測定將附腺蛋白含量最高時樣品制備的蛋白干粉溶解于預冷的無菌生理鹽水，分別配成3.2mg•mL-1、0.8mg•mL-1樣品溶液，將滅菌的6mm的圓形濾紙片分別置于這兩種濃度的雄蟲附腺溶液中浸泡1h，用已滅菌的鑷子取浸泡過的濾紙片，放置于含菌平板中，每個濃度3個重復板，空白對照為無菌蒸餾水。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌37℃培養24h，取出，觀察是否有抑菌圈，若有，則用游標卡尺測量抑菌圈直徑(包括濾紙片直徑)。
1.3.8最小抑菌濃度(MIC)的測定用倍比稀釋，將附腺蛋白含量最高時的內容物溶液稀釋成1.6、0.8、0.4、0.2、0.1mg•mL-15個濃度。每支試管中加入0.2mL對數期生長菌懸液，并用PBS作陰性對照，將不同濃度的內容物稀釋液加入到菌懸液試管中，吸取0.3mL混合液涂布培養基平板上，置于37℃下培養24h，觀察平板內有無細菌生長，以無菌生長的最低粗提取濃度作為最小抑菌濃度(溫旺榮等，1994)。每個濃度重復3次。
1.3.9溫度對長足大竹象雄性附腺抑菌影響分別取200μL附腺蛋白含量最高時的內容物溶液放入不同的滅菌試管中，將試管分別置于3、16、18、22、24、28、30℃下處理30min，根據“1.3.7”測定結果選擇適當的長足大竹象雄性附腺內容物抑菌濃度，重復“1.3.7”的步驟比較不同的溫度對長足大竹象雄性附腺抑菌活性的影響。每個處理重復3次。
1.4數據處理所有數據的整理和分析均用Microsoft的Excel2000軟件及SPSS軟件進行。
2結果與分析
2.1長足大竹象雄性附腺不同發育時期蛋白含量不同發育時期長足大竹象雄性附腺蛋白含量如表1所示，剛出土的長足大竹象成蟲雄性附腺中蛋白含量為568.75μg/頭±13.12μg/頭，在出土12h內蛋白增長十分迅速，增加了10.85%，蛋白含量達到630.43μg/頭±12.45μg/頭。而后蛋白含量的增長趨于緩和，到出土24h，達到640.57μg/頭±36.79μg/頭，蛋白含量最高。交配后2h內蛋白含量迅速下降，較追尾時下降9.29%；交配后的2~12h蛋白含量下降趨于穩定。交配12h后蛋白含量又急劇增加，達到608.36μg/頭±14.56μg/頭。到交配后的48h基本上恢復到出土24h水平。通過兩兩差異顯著性檢驗，除出土12h、出土24h和預交配0h三個時間段外，其他各個時期蛋白含量的變化差異具有高度統計學意義(P<0.01)。出土24h長足大竹象雄性附腺蛋白含量基本上達到最高，最終選擇出土24h長足大竹象雄性附腺蛋白樣品進行抑菌活性測定。
2.2抑菌活性的測定長足大竹象雄性附腺內容物粗提物的抑菌試驗結果如表1，其內容物的粗提物對屬于革蘭氏陰性菌的大腸桿菌沒有抑菌作用，但對革蘭氏陽性菌如枯草芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌作用，與空白對照相比，不同濃度的粗提物對枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌抑菌活性影響差異具有高度統計學意義(P<0.01)，抑菌活性隨著雄性附腺粗提物濃度的增加而增強。當長足大竹象雄性附腺粗提物濃度為0.8mg•mL-1時，枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌生長平板上的抑菌圈直徑分別為11.16mm、10.62mm。低于頭孢霉素在0.8mg•mL-1濃度時對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌生長平板上的抑菌圈直徑(15.78mm、17.22mm)(向玉勇等，2013)。
2.3最小抑菌濃度(MIC)的測定長足大竹象雄性附腺粗提物最小抑菌濃度的結果如表2所示，從表中可以看出附腺粗提物對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有一定的抑菌作用，最小抑菌濃度分別為0.2mg•mL-1、0.4mg•mL-1。
2.4溫度對長足大竹象雄性附腺抑菌影響不同溫度對長足大竹象雄性附腺粗提物的抑菌作用有一定影響，依據樂山地區全年平均最低溫度和最高溫度，設置3℃和30℃為邊界溫度，從表3可以看出邊界溫度條件下抑菌圈非常小，抑菌活性較低。隨著對長足大竹象雄性附腺粗提物處理溫度的升高，其抑菌作用明顯呈先上升后下降的趨勢。通過兩兩差異顯著性檢驗，28℃下粗提物對金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑與其他溫度下的對兩菌抑菌圈直徑差異具有高度統計學意義(P<0.01)。
3結論與討論
從20世紀50年代開始，有關雙翅目、鱗翅目、直翅目、鞘翅目等多個目昆蟲雄性附腺的研究已經有了一些報道(Chapman&Davies，2004；高潔等，2008)。但對于雄性附腺抗菌性的研究，迄今為止，在鞘翅目昆蟲中尚未見報道。在本研究中，我們用濾紙片法首次證明長足大竹象雄性附腺中存在抗菌蛋白，并且對革蘭氏陽性菌如枯草芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌活性。對大腸桿菌的抑制效果不明顯，可能是因為大腸桿菌為普遍存在物種，也為長足大竹象體內的天然共生群，因此未檢測到抑菌效果。這與其他學者對棕尾別麻蠅雄性附腺抑菌的研究結果相同，并且其抑菌活性明顯高于棕尾別麻蠅雄性附腺對該枯草芽孢桿菌的抑菌活性(高熹等，2007)。
在0.8mg•mL-1時本實驗長足大竹象雄性附腺粗提物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑(10.62mm)低于家蠅血淋巴粗提物對該菌的抑菌圈直徑(12.22mm)(向玉勇等，2013)。這可能是因為昆蟲抗菌肽一般是在血淋巴及消化道中產生的一類抗菌肽，專職于免疫功能的淋巴液中含有更多、更強的抑菌物質(孫恩濤，秦志輝，2006)。本研究用濾紙片法測定的長足大竹象雄性附腺最小抑菌濃度均已超出常規的敏感判定，一方面可能與抗菌肽是一類小分子，在組織內含量低，另一方面可能與使用的是長足大竹象雄性附腺的粗提物質，而不是分離純化出的純抗菌蛋白有關。究竟是何種抗菌肽,是一種或是幾種抗菌蛋白綜合起作用需要進一步研究。本研究通過不同溫度處理，發現溫度是影響長足大竹象雄性附腺粗提物抑菌活性的因素，在28℃下的粗提物抑菌效果最好。根據本文的結果，在長足大竹象出土高峰期，可以通過觀測竹林區溫度并結合其他氣候指標，對長足大竹象進行及時防治。本研究結果可為制定經濟合理的防治方案提供一定的參考依據。本研究所用的是長足大竹象雄性附腺粗提物，為深入探討其活性物質的抑菌機理，及進一步揭示生殖附腺在生殖生理中的特殊功能，需要我們對粗提物進行分離純化，從而為開展更為深入的研究以及從生殖的角度找到一條切實可行的防治對策建立基礎。
作者：梁梓 杜超豪 楊瑤君 農向 廖鴻 顏珊 單位：樂山師范學院生命科學學院