豬無透明帶卵母細(xì)胞的優(yōu)化范文

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《基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)雜志》2015年第四期

1結(jié)果與分析

1.1不同濃度的鏈霉蛋白酶消化卵母細(xì)胞后極體貼附率在不同鏈霉蛋白酶濃度下的細(xì)胞恢復(fù)率較好，由表1可知，濃度為2mg/mL鏈霉蛋白酶消化卵母細(xì)胞后極體貼附率顯著高于其它濃度消化卵母細(xì)胞的極體貼附率，1mg/mL、2mg/mL兩個(gè)濃度處理組的后期發(fā)育的亂列率顯著高于其它濃度處理組(p<0.05)，詳見圖1。

1.2不同電場強(qiáng)度對(duì)無帶卵母細(xì)胞孤雌激活效率的影響比較三組不同電場強(qiáng)度40V/mm、60V/mm、80V/mm，對(duì)卵母細(xì)胞孤雌激活效率的影響，由表2可知無帶卵母細(xì)胞在三組場強(qiáng)激活后的卵裂率差異不顯著，但80V/mm場強(qiáng)激活后的囊胚率顯著高于其它兩組的囊胚率(p<0.05)。

1.3不同脈沖次數(shù)對(duì)無帶卵母細(xì)胞孤雌激活效率的影響在相同場強(qiáng)相同脈沖時(shí)程(60V/mm,80滋s)的條件下，比較不同脈沖次數(shù)1次、2次、3次對(duì)無帶卵母細(xì)胞孤雌激活效率的影響，由表3可知無帶卵母細(xì)胞在三組不同的脈沖次數(shù)中激活后的卵裂率差異不顯著，但2次脈沖激活后的囊胚率顯著高于其它兩組的囊胚率(p<0.05)。

1.4不同微穴大小對(duì)無透明帶胚胎的容納能力比較了底部直徑約為150滋m，深度約為200滋m，簡稱(1)；底部直徑約為l20滋m，深度約為150滋m，簡稱(2)，兩種不同微穴大小對(duì)無透明帶胚胎的容納能力的大小。由表4可知，無透明帶孤雌激活胚胎在兩種穴中容納的卵裂率差異不顯著，但在(2)穴中容納的囊胚率略高于在(1)穴中容納的囊胚率，但差異不顯著，詳見圖2。

2討論

透明帶是圍繞在卵母細(xì)胞外周的糖蛋白基質(zhì)，對(duì)卵母細(xì)胞的成熟，胚胎的發(fā)育起著重要的作用。自從手工克隆技術(shù)問世以來，顛覆了一個(gè)傳統(tǒng)的概念：透明帶是胚胎發(fā)育過程所非必需的。Vajta等(2003)研究表明在有血清存在的條件下，即使卵母細(xì)胞的數(shù)量很多，用鏈酶蛋白酶消化透明帶是一種高效而無損害的方法。很多研究者都用3.3mg/mL鏈酶蛋白酶消化卵母細(xì)胞的透明帶(Vajtaetal.,2004;Lietal.,2006;Duetal.,2007)。本研究得出的最適宜透明帶消化的濃度為2mg/mL，得到的極體貼附率，卵裂率最高。這可能與卵母細(xì)胞本身的質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)室自身的體系，操作者的操作程序等因素有關(guān)。影響豬卵母細(xì)胞孤雌激活的因素有很多，比如激活液的種類、激活方法、電參數(shù)、激活時(shí)間等等，卵母細(xì)胞的活化是由這些因素的共同起作用的。其中電激活方法比較常用，Miyazaki等(1986)研究認(rèn)為對(duì)卵母細(xì)胞施加電場時(shí)，其透明帶會(huì)出現(xiàn)微孔，通過誘導(dǎo)激活I(lǐng)P3系統(tǒng)，釋放鈣庫中的Ca2+，從而激活卵母細(xì)胞。Fissore等(1992)研究表明電場強(qiáng)度、電脈沖次數(shù)等因素通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化以及卵母細(xì)胞對(duì)Ca2+敏感性的調(diào)節(jié)從而影響卵母細(xì)胞的激活。因此電激活的場強(qiáng)，脈沖參數(shù)對(duì)卵母細(xì)胞的活化是相當(dāng)關(guān)鍵的。對(duì)于無透明帶保護(hù)的卵母細(xì)胞孤雌激活的參數(shù)更值得關(guān)注。Kragh等(2005)研究表明用低場強(qiáng)60V/mm激活無帶卵母細(xì)胞的效率比激活完整透明帶的要高。本研究得出的低場強(qiáng)激活無帶卵母細(xì)胞的效率更高的結(jié)論與此是一致的。Collas等(1993)研究認(rèn)為多次使用電脈沖引發(fā)Ca2+離子持續(xù)內(nèi)流，達(dá)到真實(shí)模擬正常受精過程Ca2+的節(jié)律性脈沖升高，從而使得卵母細(xì)胞徹底激活。因此增加電脈沖次數(shù)，其激活率明顯升高。Zhu等(2002)研究表明豬卵母細(xì)胞孤雌激活中使用3次脈沖得到的囊胚率最高。Feltrin等(2006)在牛的手工克隆中使用2次電脈沖激活無透明帶胚胎得到了較高的囊胚發(fā)育率。本試驗(yàn)無帶卵母細(xì)胞的激活，得到的最佳脈沖次數(shù)為2次，與Feltrin等(2005)的研究結(jié)果相符合。培養(yǎng)無透明帶胚胎的方法有：微滴法和微穴法。Vajta等(2000)研究表明微穴培養(yǎng)法適合透明帶完整以及無透明的胚胎培養(yǎng)，而且微穴法卵裂率和囊胚率均顯著高于微滴法(20.98%vs12.77%,p<0.05)。Vajta等(2000)在牛上微滴法培養(yǎng)單個(gè)無帶胚胎囊胚率達(dá)29%，而本試驗(yàn)的囊胚率也達(dá)到20.68%，可能由于物種不同囊胚率略有差異，但與其研究結(jié)果基本一致。目前國內(nèi)對(duì)于無透明帶胚胎培養(yǎng)最佳微穴大小的報(bào)道較為少見，F(xiàn)eltrin等(2005)研究表明小尺寸微穴(內(nèi)徑130滋m,深度150滋m)中胚胎發(fā)育的卵裂率(80.9%vs64.1%)及囊胚率(25.3%vs11.9%)都高于大尺寸微穴(內(nèi)徑280滋m,深度250滋m)的發(fā)育率。本研究的試驗(yàn)結(jié)果也表明體積較小的微穴能較好地容納無透明帶囊胚，其囊胚率略高于較大微穴的囊胚，但兩者的卵裂率差異不顯著，與前者的研究結(jié)果基本一致。

3材料與方法

3.1實(shí)驗(yàn)材料

3.1.1主要試劑耗材TCM-199為GICO公司生產(chǎn)，胎牛血清(FCS)為Hyclone公司生產(chǎn)，除特別注明外，其它所有無機(jī)鹽和生物化學(xué)試劑均為Sigma公司生產(chǎn)。配制溶液的三蒸水均為南寧本地水。實(shí)體顯微鏡(日本NIKON)，CO2培養(yǎng)箱(ThermoLifeScience)，融合槽型號(hào)BTX-450(SanDiego,USA)，卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)皿：35mm及60mm塑料平皿(BDFalcon,USA)，胚胎聚集針DN-10。

3.1.2卵母細(xì)胞成熟豬的卵巢來源于南寧市屠宰場，裝入含有雙抗(青霉素、鏈霉素)25~35℃的生理鹽水中，用保溫壺4h之內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室。用10mL的注射器抽取直徑為2~6mm的卵泡，經(jīng)沉淀后收集有3層顆粒細(xì)胞包被的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(CoCs)，經(jīng)體外成熟(IVM)44h后，收集有第一極體的成熟卵母細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

3.2實(shí)驗(yàn)方法

3.2.1消化透明帶根據(jù)試驗(yàn)的要求設(shè)置不同的鏈霉蛋白酶濃度進(jìn)行透明帶的消化，待其恢復(fù)成圓形挑出留作后續(xù)試驗(yàn)。

3.2.2電激活根據(jù)試驗(yàn)的要求設(shè)置不同的電激活參數(shù)，在電融合槽中對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行激活。

3.2.3化學(xué)激活將融電激活后的卵母細(xì)胞放入含5滋g/mLCB和10滋g/mLCHX的PZM-3激活液中激活，每滴激活液中放入1枚重構(gòu)胚，激活4h。

3.2.4胚胎的培養(yǎng)將激活后的胚胎轉(zhuǎn)移到預(yù)先在CO2培養(yǎng)箱中平衡至少4h并且有石蠟油覆蓋的PZM-3中的微穴中。微穴的制備：用胚胎聚集針在四孔板底部均勻旋轉(zhuǎn)扎微穴，微穴大小根據(jù)試驗(yàn)的要求設(shè)置，每個(gè)微穴中放入1枚胚胎。48h觀察卵裂率，160~168h觀察囊胚率。

3.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)一：比較不同濃度的鏈霉蛋白酶1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL消化卵母細(xì)胞后極體貼附率及卵裂率。試驗(yàn)二：比較不同電場強(qiáng)度(40V/mm,60V/mm,80V/mm)對(duì)無帶卵母細(xì)胞孤雌激活效率的影響。試驗(yàn)三：比較不同脈沖次數(shù)(1次,2次,3次)對(duì)無帶卵母細(xì)胞孤雌激活效率的影響。試驗(yàn)四：比較不同微穴大小對(duì)無透明帶胚胎的容納能力。

3.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)所得數(shù)據(jù)由SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)每重復(fù)一次均為同一批次試驗(yàn)，使用相同來源的卵巢和試驗(yàn)條件，所有試驗(yàn)至少重復(fù)4次。

4結(jié)論

消化透明帶的最佳鏈霉蛋白酶濃度為2mg/mL；最佳電激活參數(shù)為：70V/mm電壓，80滋s脈沖時(shí)間：2次脈沖；較適宜容納孤雌激活胚胎的微穴大小為：底部直徑約為l20滋m，深度約為150滋m。作者貢獻(xiàn)呂玲燕負(fù)責(zé)論文初稿的撰寫；孫俊銘和陸杏蓉負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析及整理；潘翠玲和關(guān)志惠協(xié)助試驗(yàn)的開展；潘天彪、崔奎青和謝炳坤負(fù)責(zé)本文構(gòu)思、審閱、修改、定稿。致謝本研究由國家自然科學(xué)基金(31160457)和廣西畜牧研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目基金(桂牧研科2014-02)共同資助。

作者：呂玲燕孫俊銘陸杏蓉潘翠玲 關(guān)志惠潘天彪謝炳坤單位：廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所廣西家畜遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣西大學(xué)亞熱帶生物資源保護(hù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣西壯族自治區(qū)水牛研究所