DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)研究范文

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《中山大學(xué)學(xué)報(bào)》2015年第五期

電離輻射以及某些化學(xué)誘變劑所誘導(dǎo)的dna雙鏈斷裂損傷(DNAdoublestrandbreak，DSB)是一種非常嚴(yán)重的DNA損傷。如果細(xì)胞不能對(duì)DNA雙鏈斷裂進(jìn)行恰當(dāng)?shù)?a href="http://www.ruiyinglinkage.com/jiaoyuqikan/zsdxxb/681825.html" target="_blank">修復(fù)，通常會(huì)導(dǎo)致基因組突變或者細(xì)胞死亡。細(xì)胞中持續(xù)的DNA雙鏈斷裂損傷也會(huì)大大增加癌變的風(fēng)險(xiǎn)。所以，DNA雙鏈斷裂修復(fù)對(duì)維持基因組的穩(wěn)定性起到了至關(guān)重要的作用。除了外源性因素所誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂之外，內(nèi)源性的因素也會(huì)導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂損傷。約1%的單鏈DNA斷裂損傷(single-strandDNAle-sion，SSL)會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA損傷。同時(shí)，在同源染色體的重組過程中，DNA雙鏈斷裂損傷也有一定的幾率生成。有報(bào)道稱，在具有Bloom綜合征遺傳背景細(xì)胞中，一個(gè)細(xì)胞周期約有50個(gè)內(nèi)源性DNA雙鏈斷裂產(chǎn)生，而正常細(xì)胞中內(nèi)源性DSB水平相應(yīng)降低。這相當(dāng)于1.5～2Gy的電離輻射所誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂。在腫瘤細(xì)胞中，內(nèi)源性即本底水平的DNA雙鏈斷裂則更為顯著。在真核細(xì)胞中，DNA雙鏈斷裂的修復(fù)主要通過兩種方式:一種是同源重組(homologousrecom-bination，HR)，另一種是非同源末端連接(nonho-mologousendjoining，NHEJ)。譬如MRN復(fù)合物(由Mre11，Rad50和NBS1組成)、ATM(AtaxiaTelangiectasiaMutated)MDC1和BRCA1等相關(guān)蛋白都參與到雙鏈斷裂的修復(fù)過程中。對(duì)DSB損傷修復(fù)的動(dòng)力學(xué)研究一直是重要的課題。同時(shí)，通過系統(tǒng)生物學(xué)方法對(duì)DSB修復(fù)進(jìn)行的模型研究也不斷涌現(xiàn)。

早期的LPL(lethalandpotentiallylethal)模型以及RMR(repair-misrepair)模型是具有代表性的兩類模型。這些模型通過引入可能的一級(jí)和二級(jí)動(dòng)力學(xué)修復(fù)過程，較好的解釋了輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡現(xiàn)象。但是，對(duì)于雙鏈斷裂損傷所引發(fā)的細(xì)胞死亡動(dòng)力學(xué)，這兩類模型不能很好的進(jìn)行擬合?；谶M(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究，Stewart提出了TLK模型(Two-LesionKineticModel)。在TLK模型中，根據(jù)DNA雙鏈斷裂產(chǎn)生的復(fù)雜程度，修復(fù)經(jīng)歷了快修復(fù)和慢修復(fù)兩種過程?；赥LK模型的基本假設(shè)，Ma等利用MonteCarlo方法構(gòu)建了一個(gè)抽象的數(shù)學(xué)模型，很好的模擬了DNA雙鏈斷裂損傷的動(dòng)力學(xué)行為并因此成功的解釋了p53的數(shù)字脈沖現(xiàn)象。Ma等提出的模型被很多后續(xù)的研究者所借鑒，為進(jìn)一步的解釋細(xì)胞命運(yùn)決定機(jī)制起到了極大的推動(dòng)作用。另外，其他的一些模型則通過引入具體的分子機(jī)制對(duì)DNA雙鏈斷裂損傷的修復(fù)進(jìn)行了動(dòng)態(tài)的研究。但是，以上的這些模型并沒有充分考慮到細(xì)胞周期和DNA雙鏈斷裂損傷產(chǎn)生及修復(fù)的聯(lián)系:即只考慮了電離輻射誘導(dǎo)產(chǎn)生的外源性DNA雙鏈斷裂的動(dòng)態(tài)修復(fù)，而并沒有考慮內(nèi)源性DNA雙鏈斷裂的動(dòng)態(tài)變化。在輻射刺激下，細(xì)胞會(huì)發(fā)生細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象，并修復(fù)輻射誘導(dǎo)的DNA損傷。當(dāng)DNA損傷降低到特定閾值以下，細(xì)胞周期將被重啟。細(xì)胞周期重啟后，細(xì)胞周期伴隨的內(nèi)源性DNA雙鏈斷裂將不斷產(chǎn)生，并得到動(dòng)態(tài)修復(fù)。所以，我們提出了一個(gè)改良的MonteCarlo模型，并綜合考慮了外源性和內(nèi)源性DNA雙鏈斷裂損傷的動(dòng)態(tài)修復(fù)過程，從而更真實(shí)的模擬了細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下的DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)的動(dòng)力學(xué)行為。

1材料與方法

1.1DNA雙鏈斷裂損傷概述DNA雙鏈損傷修復(fù)模型分為兩個(gè)模塊:分別為輻射誘導(dǎo)(外源性)DNA損傷修復(fù)和內(nèi)源性DNA損傷修復(fù)模塊。兩個(gè)模塊都基于Stewart模型的基本假設(shè)，即根據(jù)損傷的復(fù)雜程度，DSB修復(fù)分為快修復(fù)和慢修復(fù)兩種動(dòng)力學(xué)形態(tài)［7］。DNA修復(fù)過程通過MonteCarlo過程來模擬。

1.2外源性和內(nèi)源性DSB數(shù)目初始化

1.2.1輻射誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂修復(fù)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，1Gy的輻射劑量約產(chǎn)生30個(gè)DSB。為了充分考慮DSB生成的隨機(jī)化，根據(jù)Ma等的假設(shè)，我們?cè)O(shè)定DSB的生成服從Poisson分布，其參數(shù)λ=30•IR，這里IR為輻射劑量。根據(jù)Ma等的假設(shè)，70%的總DSB被快修復(fù)，而剩余的30%的DSB經(jīng)歷慢修復(fù)過程。

1.2.2內(nèi)源性DNA雙鏈斷裂修復(fù)假設(shè)內(nèi)源性的DSB主要在細(xì)胞周期過程中產(chǎn)生。進(jìn)一步限定，所有的DSB均在細(xì)胞周期中的S期和G2/M期產(chǎn)生，并服從均勻分布。為了簡(jiǎn)化模型，對(duì)細(xì)胞周期的時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行了限定，即長(zhǎng)度為20h，其中G1，S和G2/M期的比例設(shè)為3∶4∶3。如文獻(xiàn)報(bào)道，乳腺癌腫瘤細(xì)胞MCF7的細(xì)胞周期約為20h，其中G1，S和G2/M期時(shí)長(zhǎng)分別為6、8和6h，且周期不受外源輻射刺激影響。本模型關(guān)于細(xì)胞周期的時(shí)長(zhǎng)以及內(nèi)源性DSB發(fā)生時(shí)間的設(shè)定亦可設(shè)為它值(包括設(shè)置為隨機(jī)變量)，且不會(huì)對(duì)模型動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生定性的影響。在一個(gè)細(xì)胞周期中，我們?cè)O(shè)定將有50個(gè)DSB發(fā)生［3］。由于同源染色體重組等事件可誘發(fā)DSB，所以DSB產(chǎn)生主要處于S期。因此，假設(shè)其中40個(gè)產(chǎn)生于S期，剩余10個(gè)產(chǎn)生于G2/M期。在內(nèi)源性DNA損傷修復(fù)模塊中，我們?cè)O(shè)定每一個(gè)生成的內(nèi)源性DSB將有70%的概率被快修復(fù)，有30%的概率被慢修復(fù)。

1.3DSB修復(fù)的一般過程為了偶聯(lián)外源性和內(nèi)源性DSB修復(fù)的過程，我們?cè)O(shè)定發(fā)生細(xì)胞周期阻滯(cellcyclearrest)的閾值為50個(gè)DSB。有文獻(xiàn)報(bào)道，正常細(xì)胞中當(dāng)DSB水平小于20時(shí)，細(xì)胞周期阻滯將停止。但腫瘤細(xì)胞可以耐受更高水平的DNA損傷，所以我們將腫瘤細(xì)胞的閾值相應(yīng)提高。當(dāng)總DSB數(shù)目≤50時(shí)，細(xì)胞周期將被重啟。DSB的修復(fù)遵循如下過程。1.4DSB修復(fù)模型模擬工具隨機(jī)模擬通過MATLAB(MathWork，版本號(hào)7.12.0.635，R2011a)實(shí)現(xiàn)。

2結(jié)果

2.1DSB修復(fù)的動(dòng)態(tài)變化通過運(yùn)行MATLAB腳本程序，獲得了200組MonteCarlo模擬結(jié)果。圖2中對(duì)應(yīng)的初始外源性輻射刺激為5Gy。具體為:產(chǎn)生200個(gè)隨機(jī)數(shù)，這些隨機(jī)數(shù)服從λ=150(5×30)的Poisson分布。接著將200個(gè)隨機(jī)數(shù)作為初始刺激水平。隨機(jī)數(shù)的產(chǎn)生運(yùn)用到了MATLAB的庫(kù)函數(shù)poissrnd。產(chǎn)生的200組初始DSB分布可參見圖2A。圖2B示部分隨機(jī)DSB修復(fù)模型的模擬結(jié)果。發(fā)現(xiàn)DSB的修復(fù)在時(shí)間序列上呈現(xiàn)出很大的變異性，表現(xiàn)在每個(gè)細(xì)胞初始的DSB水平不同，這種變異是由所產(chǎn)生的200組符合Poisson分布的隨機(jī)數(shù)引起的。同時(shí)，細(xì)胞中DSB的修復(fù)速率也存在較大變異。當(dāng)細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期后，DSB的修復(fù)往往呈現(xiàn)一種非單調(diào)的動(dòng)態(tài)變化(圖2B)。一些自發(fā)產(chǎn)生的內(nèi)源性DNA損傷使得總體DSB數(shù)目經(jīng)歷不同水平的瞬間上升。當(dāng)自發(fā)DNA損傷產(chǎn)生較集中而修復(fù)能力相對(duì)較弱時(shí)，總體DSB水平會(huì)有更為顯著的升高(圖2B，左圖)。我們也注意到:在外源輻射施加24h后，細(xì)胞中仍然存在較高水平的DNA雙鏈損傷(圖2B)。即使將模擬時(shí)間延長(zhǎng)到48h，這種動(dòng)態(tài)行為仍然存在(圖2C)。我們分別統(tǒng)計(jì)了200組隨機(jī)模擬試驗(yàn)中最低的DSB水平(注:時(shí)長(zhǎng)為48h)。從柱狀圖中我們可以發(fā)現(xiàn)，所有的200組模擬結(jié)果都表明細(xì)胞中存在著未被修復(fù)的DNA損傷，同時(shí)在某些細(xì)胞中，DNA損傷可能一直維持在較高的水平(圖2C)。這些結(jié)果表明，細(xì)胞中DSB修復(fù)存在著較為顯著的變異，同時(shí)細(xì)胞也具有較高水平的本底DNA損傷。

2.2DSB修復(fù)過程中的變異性從圖2可知DSB修復(fù)的動(dòng)態(tài)過程存在著較大的變異性。為了進(jìn)一步描述這種變異行為，對(duì)200組時(shí)間序列進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，DSB的修復(fù)存在著較為顯著的變異性(圖3A)。在DSB修復(fù)的初期，這種變異性較小，表現(xiàn)為較窄的置信區(qū)間。從平均水平上而言，DSB修復(fù)過程的半衰期(即令DSB水平下降到初值一半的時(shí)間)約為3.24h。而從約2h到10h這段時(shí)間內(nèi)，DSB修復(fù)的變異相對(duì)較大(圖3A)。這種相對(duì)較顯著的變異可能是由早期外源性DNA的隨機(jī)修復(fù)引起的。與內(nèi)源性DSB不同的是，外源DSB的發(fā)生服從Poisson分布，從而在隨機(jī)修復(fù)的基礎(chǔ)上引入了額外的不確定性。隨著時(shí)間的推移，隨機(jī)修復(fù)合并初值隨機(jī)分布的變異將愈發(fā)顯著，進(jìn)而可能導(dǎo)致DSB的修復(fù)在半衰期附近存在較大變異。當(dāng)較多的外源性DSB得到了修復(fù)后，總DSB接近于重新觸發(fā)細(xì)胞周期的水平。由于未被修復(fù)的DSB水平較之初始狀態(tài)顯著降低，所以隨機(jī)修復(fù)的變異也隨之下降。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)了200組模擬的半衰期。結(jié)果顯示，DSB的半衰期亦存在著較為明顯的變異(圖3B)。同時(shí)，半衰期的分布與時(shí)間序列中變異較為顯著的區(qū)域也具有一定的吻合。以上結(jié)果暗示，DSB的損傷修復(fù)具有較為顯著的變異性。

3討論

本文提出了一個(gè)更為精細(xì)化的DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)模型。在這個(gè)模型中，考慮了外源性和內(nèi)源性DSB在修復(fù)過程中的偶聯(lián)，并對(duì)此模型進(jìn)行了MonteCarlo模擬。模擬結(jié)果顯示，DSB的修復(fù)具有顯著的變異性(圖2、圖3)。同時(shí)，由于本底水平即內(nèi)源性DNA損傷的隨機(jī)發(fā)生，DSB的動(dòng)態(tài)變化并非呈現(xiàn)一種單調(diào)降低的行為(圖2B)。這種非單調(diào)的行為是以往的模型所忽視的。最近Loe-wer等的實(shí)驗(yàn)顯示腫瘤細(xì)胞中的DNA雙鏈損傷可能呈現(xiàn)非單調(diào)的動(dòng)態(tài)行為，從而為本文模擬結(jié)果提供了依據(jù)。所以，本文模型可以較好的模擬細(xì)胞完整生命周期中的DSB損傷修復(fù)行為。值得注意的是Ma等之前的模型并沒有考慮具體的DSB修復(fù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，轉(zhuǎn)而根據(jù)TLK的基本假設(shè)提出了一個(gè)較為抽象的模型。其優(yōu)勢(shì)在于DSB修復(fù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)仍存在較大的未知，且已知參與修復(fù)的蛋白復(fù)合物相互作用較為復(fù)雜。

若采用常規(guī)的常微分方程建模方法，將極大的增加模型的復(fù)雜程度。運(yùn)用抽象的MonteCarlo模擬方法既能較好的模擬DSB修復(fù)的隨機(jī)動(dòng)力學(xué)行為，同時(shí)又能巧妙的回避具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的未知因素。所以，本文基于Ma等的模型，提出了DSB修復(fù)的更為完整的模型，即同時(shí)考慮內(nèi)源性和外源性DSB損傷的修復(fù)過程及其偶聯(lián)效應(yīng)，更好的描述了細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下的DSB修復(fù)過程。需要注意的是，本模型參數(shù)主要基于腫瘤細(xì)胞相關(guān)研究進(jìn)行的估計(jì)，所以此模型旨在描述非正常細(xì)胞的DSB修復(fù)行為［18］。對(duì)于正常的細(xì)胞而言，本底水平的DSB數(shù)量較之腫瘤細(xì)胞顯著的降低，同時(shí)觸發(fā)細(xì)胞周期阻滯的DSB閾值也較低。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞中的基因突變很可能導(dǎo)致正確修復(fù)速率的顯著降低。綜合以上的因素，正常細(xì)胞中的DSB修復(fù)可能具有更高的效率，從而使得正常細(xì)胞中的DSB修復(fù)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)可能會(huì)與腫瘤細(xì)胞中的相關(guān)性質(zhì)具有一定的差異。通過改變模型參數(shù)(如增大kfix1或減少內(nèi)源性DSB總量)，即可對(duì)正常細(xì)胞的DSB修復(fù)進(jìn)行定性的模擬。所以，本模型具有一定的普適性。

提出較為完整的DSB修復(fù)模型對(duì)于其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)動(dòng)力學(xué)行為研究也具有很大的必要性。譬如ATM可以作為感受器感知DSB的變化，并得到活化?；罨腁TM可以作為激酶磷酸化p53蛋白并借此與復(fù)雜的p53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)建立直接的聯(lián)系。P53在未受刺激和應(yīng)激狀態(tài)下(如電離輻射和紫外線)都表現(xiàn)出復(fù)雜的動(dòng)力學(xué)行為。以往描述p53動(dòng)力學(xué)模型中的DNA損傷修復(fù)模塊都沒有很好的考慮外源性和內(nèi)源性DNA損傷的協(xié)同作用，所以不能很好的同時(shí)解釋p53在受迫和未受迫狀態(tài)下的動(dòng)力學(xué)行為。所以，本模型可能有助于其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)力學(xué)行為研究。譬如內(nèi)源性的DNA損傷會(huì)在非受迫狀態(tài)下觸發(fā)p53的自發(fā)脈沖，那么就為研究p53的本底動(dòng)力學(xué)和p53單細(xì)胞動(dòng)力學(xué)中存在的線性現(xiàn)象提供了可能。此外，DSB修復(fù)模型與細(xì)胞周期信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的偶聯(lián)也可能有助于模擬更為真實(shí)的細(xì)胞周期中的動(dòng)力學(xué)現(xiàn)象［26］。DNA損傷修復(fù)與特定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的相互作用也可能產(chǎn)生反饋或前饋?zhàn)饔?，從而產(chǎn)生更為復(fù)雜的動(dòng)力學(xué)行為。隨著對(duì)DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)過程認(rèn)識(shí)的不斷深入，建立更為精細(xì)化的基于具體分子機(jī)制的DNA損傷修復(fù)模型并結(jié)合恰當(dāng)?shù)碾S機(jī)模擬方法將有助于實(shí)現(xiàn)對(duì)損傷修復(fù)過程更為精確的定量研究。

作者：孫廷哲 崔雋 單位：安慶師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 基因工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院