漾濞泡核桃花中總黃酮含量探究范文

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《大理大學(xué)學(xué)報(bào)》2016年第8期

摘要：

目的：優(yōu)選漾濞泡核桃花總黃酮的提取工藝，建立漾濞泡核桃花總黃酮含量測(cè)定的方法。方法：在單因素考察基礎(chǔ)上，用正交試驗(yàn)法對(duì)漾濞泡核桃花總黃酮的提取工藝優(yōu)選，并以蘆丁為對(duì)照品，采用差示分光光度法測(cè)漾濞泡核桃花總黃酮含量。結(jié)果：漾濞泡核桃花總黃酮最佳提取工藝為：提取溶劑50%乙醇，料液比1：20，沸水加熱回流3次，每次40min；漾濞泡核桃花總黃酮濃度在11~77μg/mL范圍內(nèi)與吸光度成良好線性關(guān)系（r=0.9993），平均加樣回收率為99.7%，RSD為1.94%，總黃酮的含量為2.16%~2.82%。結(jié)論：此方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠，可作為漾濞泡核桃花總黃酮的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞：

漾濞泡核桃花；差示分光光度法；總黃酮；含量測(cè)定

泡核桃又名漾濞核桃，系胡桃亞科Juglandaceae胡桃屬Juglans植物〔1〕，主要分布在云南、貴州、四川等地〔2〕。2013年3月，國(guó)家質(zhì)檢總局批準(zhǔn)對(duì)漾濞泡核桃實(shí)施地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)。核桃植株全身都是寶，除了其果仁可食用外，核桃枝、核桃花、核桃殼、核桃葉等都可入藥〔3〕。核桃花即核桃花柱，又稱核桃紐，長(zhǎng)壽菜，龍須菜，含有豐富的磷脂，有益于增強(qiáng)人體細(xì)胞活力，促進(jìn)人體造血功能，能有效降低血脂，膽固醇，預(yù)防動(dòng)脈硬化，此外核桃花酊劑可治疣子〔4〕。賈忠等〔5〕從核桃花中分離鑒定了7個(gè)黃酮類化合物。趙磊等〔6〕采用HPLC-DAD對(duì)核桃花中槲皮素與山奈酚進(jìn)行了含量測(cè)定，李少泓等〔7〕采用紫外分光度法對(duì)蘭州的核桃花總黃酮進(jìn)行了含量測(cè)定。因核桃花的提取物具有較深的顏色，對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較大，故本實(shí)驗(yàn)采用差示分光光度法消除背景吸收的干擾，測(cè)定漾濞泡核桃花總黃酮含量，以期為漾濞泡核桃花的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.1儀器

TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；CP224C電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；電子恒溫水浴鍋（上?？莆鲈囼?yàn)儀器廠）；超聲波清潔器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2藥品與試劑

蘆?。ㄖ袊?guó)藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)：080-9303）；乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等試劑均為分析純；漾濞泡核桃花2013年4月采于漾濞縣平坡鎮(zhèn)（由大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院楊月娥老師鑒定為JuglanssigillataDode.的花），樣品編號(hào)為1#~6#，將核桃花置陰涼通風(fēng)的地方自然風(fēng)干，粉碎備用。

2實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

2.1溶液制備

2.1.1蘆丁對(duì)照品溶液的制備

精密稱取在40℃下干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品5.5mg置于25mL量瓶中加入適量50%乙醇溶解，定容，搖勻，得0.22mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。

2.1.2樣品溶液的制備

精密稱取1#樣品0.5g，置100mL的燒瓶中，加入50%的乙醇溶液10mL，加熱回流3次，每次40min，過(guò)濾，合并濾液后定容至50mL，即得樣品溶液。

2.2測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

精密移取“2.1.1”對(duì)照品溶液1mL和“2.1.2”樣品溶液2mL，分別置于10mL量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.2mL搖勻，放置6min，加入10%硝酸鋁溶液0.2mL搖勻，放置6min，再加入4%氫氧化鈉1mL，搖勻放置15min后定容，采用差示分光光度法在400~800nm進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果表明，蘆丁對(duì)照品和樣品在510nm處均有最大吸收，與文獻(xiàn)〔7-8〕報(bào)道一致，故選擇510nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3供試品溶液制備方法的考察

2.3.1提取方法的選擇

取1#樣品10份（編號(hào)1至10號(hào)），每份約0.5g，精密稱定，分別加入40%乙醇10mL，其中第1、2號(hào)浸泡12h后直接過(guò)濾，第3、4號(hào)浸泡12h后加熱回流40min后過(guò)濾，第5、6號(hào)直接加熱回流40min后過(guò)濾，第7、8號(hào)直接超聲40min后過(guò)濾，第9、10號(hào)浸泡12h后超聲40min后過(guò)濾，均定容至50mL。分別取各試液2mL，于10mL量瓶中，按“2.2”方法顯色，以各樣品提取液作為空白對(duì)照，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮提取率。結(jié)果表明加熱回流提取法的黃酮提取率均大于超聲提取法，浸泡12h后加熱回流與直接加熱回流2種提取方法吸光度接近，故本實(shí)驗(yàn)采用直接加熱回流的方法。

2.3.2料液比的選擇

精密稱取1#樣品7份，每份約0.5g，以3：1、6：1、9：1、12：1、15：1、20：1、25：1的料液比加入40%的乙醇，在沸水浴中加熱回流40min后過(guò)濾，濾液定容為50mL。分別取各試液2mL，于10mL量瓶中，按“2.2”方法顯色，以各樣品提取液作為空白對(duì)照，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮提取率。見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，料液比為20：1時(shí)總黃酮提取率最大，故本實(shí)驗(yàn)采用的最佳料液比為20：1。

2.3.3提取時(shí)間的選擇

精密稱取1#樣品5份，每份約0.5g，加入40%的乙醇10mL，分別在沸水浴中加熱回流20、30、40、50、60min后過(guò)濾，濾液定容為50mL。分別取各試液2mL，于10mL量瓶中，按“2.2”方法顯色，以各樣品提取液作為空白對(duì)照，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮提取率。見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，加熱回流40min時(shí)總黃酮提取率較大，故本實(shí)驗(yàn)采用的最佳提取時(shí)間為40min。

2.3.4提取溫度的選擇

精密稱取1#樣品6份，每份約0.5g，加入40%的乙醇10mL，分別在40、50、60、70、80℃，沸水浴中加熱回流40min后過(guò)濾，濾液定容為50mL。分別取各試液2mL，于10mL量瓶中，按“2.2”方法顯色，以各樣品提取液作為空白對(duì)照，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮提取率。見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，隨溫度的增加，總黃酮提取率變大，沸水時(shí)最大，故本實(shí)驗(yàn)采用的最佳提取溫度為沸水。

2.3.5乙醇濃度的選擇

精密稱取1#樣品8份，每份約0.5g，加入20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇10mL，分別在沸水浴中加熱回流40min后過(guò)濾，濾液定容為50mL。分別取各試液2mL，于10mL量瓶中，按“2.2”方法顯色，以各樣品提取液作為空白對(duì)照，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮提取率。見(jiàn)圖4。結(jié)果用40%乙醇總黃酮的提取率最高，因此選擇40%乙醇為提取溶劑。

2.3.6提取次數(shù)的考察

精密稱取1#樣品3份，每份約0.5g，加入40%的乙醇10mL，分別在沸水浴中加熱回流1、2、3次，每次加熱40min后過(guò)濾，濾液定容為50mL。分別取各試液2mL，于10mL量瓶中，按“2.2”方法顯色，以各樣品提取液作為空白對(duì)照，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮提取率。見(jiàn)圖5。結(jié)果表明，隨著提取次數(shù)的增加，總黃酮提取率變大，在提取3次的情況下總黃酮提取率最大，故本實(shí)驗(yàn)采用的最佳提取次數(shù)為3次。單因素考察泡核桃花總黃酮的提取方法為加入40%的乙醇料液比為1：20，在沸水浴中加熱回流3次，每次40min。

2.4正交試驗(yàn)考察

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)核桃花總黃酮的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，選用L9（34）正交試驗(yàn)，選擇提取次數(shù)（A）、提取時(shí)間（B）、乙醇濃度（C）、料液比（D）4個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平。確立因素水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，4種因素對(duì)提取結(jié)果影響大小依次為提取次數(shù)>提取時(shí)間>料液比>乙醇濃度。核桃花總黃酮提取最佳條件組合為A3B1C3D2，即最佳條件為50%乙醇濃度，料液比為1：20，提取3次，每次時(shí)間為40min，總黃酮提取率最高。

2.5驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

精密稱取1#樣品3份，每份約0.5g，按正交試驗(yàn)的最佳條件提取樣品溶液，按“2.2”方法顯色，以樣品提取液作為空白對(duì)照，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮提取率。結(jié)果總黃酮提取率為2.19%，RSD為1.67%。

3方法學(xué)考察

3.1線性關(guān)系考察

精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL分別于10mL量瓶中，按“2.2”方法顯色，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得到線性方程：Y=0.0118C+0.016，r=0.9993，結(jié)果表明蘆丁在11~77μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2顯色穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品溶液2mL，于10mL量瓶中，按“2.2”方法顯色，以樣品提取液作為空白對(duì)照，分別放置0、0.5、1、2、4、6h，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，RSD為1.56%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品6h內(nèi)顯色穩(wěn)定性良好。

3.3樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

取放置時(shí)間為0、0.5、1、2、4、6h的同一樣品試液2mL，于10mL量瓶中，按“2.2”方法顯色，以樣品提取液作為空白對(duì)照，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，RSD為2.19%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品在6h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4儀器精密度試驗(yàn)

取同一樣品溶液2mL，平行6份，于10mL量瓶中，按“2.2”方法顯色，以樣品提取液作為空白對(duì)照，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，RSD為1.05%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，儀器精密度良好。

3.5重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取1#樣品6份，每份約0.5g，按“2.1.2”項(xiàng)下制備樣品溶液，按“2.2”方法顯色，以樣品提取液作為空白對(duì)照，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，代入回歸方程計(jì)算黃酮提取率。測(cè)得核桃花中總黃酮平均含量為2.24%，RSD為2.05%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性良好。

3.6加樣回收率試驗(yàn)

取已知總黃酮含量（2.24%）的1#樣品約0.25g，平行6份，精密稱定，加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，按“2.1.2”項(xiàng)下制備樣品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法顯色，以樣品提取液作為空白對(duì)照，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率。見(jiàn)表4。

3.7樣品含量測(cè)定

精密稱取1#~6#核桃花粉末各3份，每份約0.5g。按“2.1.2”項(xiàng)下制備樣品溶液，按“2.2”方法顯色，以樣品提取液作為空白對(duì)照，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，代入回歸方程計(jì)算黃酮提取率。見(jiàn)表5。

4討論

目前已有文獻(xiàn)報(bào)道核桃花內(nèi)含有大量天然黑色素，且該色素易溶于水和乙醇〔9〕，李少泓等〔7〕采用紫外分光度法對(duì)核桃花中總黃酮進(jìn)行含量測(cè)定，但并未考慮核桃花提取液中色素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。另有文獻(xiàn)報(bào)道采用比色法測(cè)總黃酮含量時(shí)會(huì)產(chǎn)生較大誤差〔10-11〕。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，掃描未顯色樣品提取液，在510nm處吸光度大于0.2，測(cè)樣品溶液時(shí)，以空白試劑為參比測(cè)得的吸光度比以未顯色樣品溶液為參比時(shí)的吸光度大。由吸光度過(guò)高或過(guò)低引起較大測(cè)量誤差時(shí)采用差示分光光度法能提高其精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度，故本實(shí)驗(yàn)采用差示分光光度法。以NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色，并以等量未顯色的提取液作為參比，在510nm處測(cè)定漾濞泡核桃花中的總黃酮含量，消除背景吸收的干擾。該方法操作簡(jiǎn)單，有良好的穩(wěn)定性、重復(fù)性和準(zhǔn)確度。

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作者:蘇敏 楊盛春 周萍 單位:大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院