山梨醇對凡納濱對蝦無水運輸代謝影響范文

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摘要：將馴化后體質(zhì)量（12.86±0.80）g的凡納濱對蝦（Litopenaeusvannamei）隨機分為兩組，分別在13℃的3.5%山梨醇溶液或清水（對照）中浸泡3min，至全部對蝦側(cè)臥水底呈休眠狀態(tài)后，取30只一組裝入聚氯乙烯（polyvinylchloride，PVC）袋（220mm×320mm），充純氧后密封，置于15℃的恒溫箱中無水運輸。10小時后將全部對蝦轉(zhuǎn)移至的清水（20℃~25℃）中復(fù)蘇。測定休眠5、10h和復(fù)蘇1h狀態(tài)下凡納濱對蝦血清血藍蛋白、乳酸、葡萄糖濃度、乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）、肝胰腺琥珀酸脫氫酶（succinatedehydrogenase，SDH）活力和肝糖原含量的變化，以探究山梨醇對凡納濱對蝦無水運輸存活率的影響及其作用機理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模擬無水運輸10小時后，山梨醇組對蝦存活率為88.89%，顯著高于對照組（71.11%）（P<0.05）；休眠狀態(tài)下，山梨醇組血藍蛋白、乳酸、血糖濃度和SDH、LDH活力顯著高于對照組（P<0.05），肝糖原濃度顯著低于對照組（P<0.05）；復(fù)蘇1小時后，兩組對蝦的乳酸、血糖濃度及對照組SDH活力仍與新鮮狀態(tài)差異顯著（P<0.05），其他參數(shù)恢復(fù)正常水平。結(jié)果表明，3.5%山梨醇可提高對蝦有氧和無氧呼吸強度及存活率，緩解低、缺氧和能量不足的脅迫。

關(guān)鍵詞：凡納濱對蝦；無水運輸；呼吸代謝；能量代謝；山梨醇

凡納濱對蝦（Litopenaeusvannamei）（又稱南美白對蝦）營養(yǎng)豐富，肉質(zhì)鮮美，是我國最主要的養(yǎng)殖蝦類。2016年我國養(yǎng)殖凡納濱對蝦總產(chǎn)量超過93萬噸，比2015年增長4.38%[1]。我國地域廣闊，水產(chǎn)品運輸耗時長，保活難度大。目前市場鮮活魚蝦等水產(chǎn)的運輸方式主要為有水運輸，受季節(jié)、溫度、運輸距離影響較大，運輸?shù)某杀靖摺⑿实蚚2]。采用無水運輸可以減輕運輸重量，減少容器體積，有效降低運輸成本，特別適用于快遞和航空運輸[3]。無水運輸時，水產(chǎn)品暴露在空氣和低溫環(huán)境中，受到刺激和脅迫產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)[4-5]。短暫的應(yīng)激很快能恢復(fù)，但長期的應(yīng)激會損傷機體的免疫、代謝系統(tǒng)，甚至危害健康，導(dǎo)致死亡，更影響水產(chǎn)品的品質(zhì)。目前，緩解水產(chǎn)運輸應(yīng)激的方法主要為麻醉處理，比如用間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸（3-Aminobenzoicacidethylestermethanesulfonate，MS-222）[6-7]、丁香酚[8]和CO2[9]等，但這些方法存在藥物劑量難以控制，有殘毒等弊端。不同甲殼動物的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理代謝調(diào)節(jié)功能不同，在無水條件下存活時間差異很大。有研究表明，相比多數(shù)甲殼動物，有些蟹類在無水的條件下可以存活更長時間，這與它們的體型和鰓結(jié)構(gòu)的進化密不可分[10]。這些蟹的鰓和甲殼的結(jié)構(gòu)能夠有效防止水分蒸發(fā)，保持鰓的濕潤，使其在空氣中依然可以正常獲取氧氣[11-12]。山梨醇是一種由葡萄糖還原生成的小分子糖醇，易溶于水，水溶液為透明黏稠的液體。山梨醇的分子結(jié)構(gòu)中含有親水基團羥基，具有一定的吸濕性。前期研究表明，3.5%山梨醇溶液浸泡處理可以有效提高凡納濱對蝦的無水存活率。本試驗分析凡納濱對蝦在模擬無水保活運輸中血清和肝胰腺生理生化變化規(guī)律，重點從呼吸和能量代謝的角度研究山梨醇對凡納濱對蝦的影響，為有效減緩凡納濱對蝦的應(yīng)激脅迫傷害，提高無水保活運輸效率。

1材料與方法

1.1材料與試劑凡納濱對蝦購于杭州市蕭山喬四養(yǎng)殖場，體質(zhì)量（12.86±0.80）g，體長（13.94±2.55）cm。試驗前連續(xù)充氣暫養(yǎng)12h[水溫（18±2）℃，鹽度35g/L]，棄用死蝦和活力差的蝦。山梨醇、三羥甲基氨基甲烷（Tris，分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；氯化鈉、乙二胺四乙酸二鈉二水合物（EDTA-2Na-2H2O）、蔗糖、鹽酸（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；琥珀酸脫氫酶（succinatede－h(huán)ydrogenase，SDH）試劑盒、血清乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）試劑盒、乳酸試劑盒、肝糖原試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2儀器與設(shè)備722E型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；MB16-414酶標(biāo)儀：美國伯騰儀器有限公司；S-20氧氣泵：浙江寧波賽爾電氣有限公司；氧氣罐：杭州電化集團燃?xì)庥邢薰荆籑10557全自動氣調(diào)包裝機：北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司；CPIIO2/CO2氣體分析儀：丹麥丹圣（上海）貿(mào)易有限公司。

1.3方法凡納濱對蝦隨機分為試驗組和對照組，每組30尾對蝦，設(shè)置4個平行。分別在13℃的3.5%山梨醇溶液或清水（對照）中浸泡（冷擊）3min，至全部對蝦側(cè)臥水底呈休眠狀態(tài)。休眠的對蝦每30只一組裝入聚氯乙烯（polyvinylchloride，PVC）袋（220mm×320mm）充純氧后密封，置于恒溫箱（15℃）中模擬無水運輸。10h后將全部對蝦轉(zhuǎn)移至20℃~25℃的清水中復(fù)蘇至能夠游動。

1.4取樣與指標(biāo)測定血淋巴采集及血清的制備：用吸水紙吸干對蝦體表水分，用一次性1mL無菌注射器從對蝦的頭胸甲與第一腹節(jié)間插入至心臟抽取血淋巴，每10只對蝦的血淋巴合并，注入1.5mL離心管中。4℃靜置過夜后于4℃、800×g離心10min，去除血細(xì)胞，取上層清液即為血清，分裝并儲存于-80℃冰箱中，用于測定血藍蛋白、乳酸和血糖含量及LDH活力。肝胰腺采集以及勻漿制備：用吸水紙吸干對蝦體表水分，在冰盤上迅速解剖取出肝胰腺，用少量冰冷的生理鹽水（0.86%）漂洗去除血液，濾紙吸干水分后放入1.5mL離心管中，迅速放入液氮中，保存于-80℃冰箱中待測。取解凍的肝胰腺0.2g~1.0g至小燒杯，加入9倍肝胰腺重量的預(yù)冷勻漿介質(zhì)（pH7.4，0.01mol/LEDTA-2Na，0.01mol/L蔗糖，0.8%氯化鈉溶液）。冰浴下用均漿機研磨制成10%組織勻漿（勻漿時間10s/次，間隙30s，連續(xù)3次~5次）。取勻漿在4℃以3000r/min~5000r/min離心10min~15min，棄沉淀，取上清液測定SDH活力和肝糖原含量。SDH和LDH的活力、乳酸、肝糖原濃度采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行測定。血糖送樣至浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院附屬醫(yī)院檢測。血漿血藍蛋白含量的測定參考Nickerson等[13]的方法并加以改進[14]。取解凍的血清樣品10μL加入990μL磷酸緩沖鹽溶液（phosphatebuffersaline，PBS）混勻，充分震蕩，避免產(chǎn)生氣泡，在波長334nm處測量其吸光度。以PBS緩沖液為空白對照。血藍蛋白濃度用下式計算：E334nm（mg/mL）=2.30×OD334nm×1001.5數(shù)據(jù)處理試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SE）表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析，用Duncan氏檢驗進行多重比較，以P<0.05作為差異顯著水平。

2結(jié)果與分析

2.1凡納濱對蝦無水運輸?shù)拇婊盥誓M無水運輸10小時后，山梨醇組對蝦的存活率為88.89%，對照組為71.11%，山梨醇浸泡顯著提高了凡納濱對蝦無水運輸?shù)拇婊盥剩≒>0.05）。

2.2凡納濱對蝦琥珀酸脫氫酶活力和血藍蛋白含量的變化無水運輸過程中凡納濱對蝦肝胰腺琥珀酸脫氫酶SDH活力和血清血藍蛋白含量的變化見圖1。由圖1（A）可知，短時低溫刺激后，山梨醇組和對照組間SDH活力差異不顯著（P>0.05）。對蝦休眠10小時內(nèi)，各組SDH活力逐漸下降；休眠5h，山梨醇組SDH活力由新鮮狀態(tài)的3.556U/mgprot降低至2.588U/mgprot，顯著高于對照組的1.482U/mgprot（P<0.05）；休眠10h，山梨醇組SDH活力雖繼續(xù)降低，但仍高于對照組，兩組間差異不顯著（P>0.05）。復(fù)蘇1h后，山梨醇組SDH活力恢復(fù)至正常狀態(tài)，對照組SDH活力未完全恢復(fù)，仍低于新鮮水平。凡納濱對蝦血清血藍蛋白含量變化如圖1（B）所示。新鮮狀態(tài)下凡納濱對蝦的血清血藍蛋白含量為17.85mg/mL；低溫冷擊后，兩組血藍蛋白含量都顯著升高（P<0.05），但組間無顯著差異（P>0.05）。休眠過程中，凡納濱對蝦血清血藍蛋白含量繼續(xù)升高，并保持在較高水平。休眠5h，山梨醇組血藍蛋白含量顯著高于對照組（P<0.05）；休眠10h兩組血藍蛋白含量無顯著差異（P>0.05）；復(fù)蘇1小時后，兩組血藍蛋白含量下降，均恢復(fù)到正常水平。

2.3凡納濱對蝦乳酸脫氫酶活力和乳酸濃度的變化山梨醇對模擬無水運輸過程中對蝦血清LDH活力和乳酸濃度的影響見圖2。由圖2可知，低溫冷擊后，兩組對蝦LDH活力都顯著升高（P<0.05），乳酸濃度升高但變化不顯著（P>0.05）；休眠5h，LDH保持升高趨勢，山梨醇組LDH活力顯著高于對照組（P<0.05）；休眠10h，山梨醇組和對照組LDH活力略有下降，但仍為新鮮狀態(tài)的2.63倍和2.59倍。休眠過程中對蝦血清乳酸濃度不斷上升，第10小時達到最大值，山梨醇組乳酸濃度為2.70mmol/L，顯著高于對照組（2.08mmol/L）（P<0.05）。在常溫清水中復(fù)蘇1小時后，兩組對蝦LDH活力恢復(fù)到正常狀態(tài)，乳酸濃度略有下降但仍高于新鮮水平。整個模擬運輸過程中，乳酸濃度的變化比LDH活力變化滯后。

2.4凡納濱對蝦血糖濃度和肝糖原含量的變化無水保活運輸過程中凡納濱對蝦血清葡萄糖濃度和肝糖原含量的變化見圖3。從圖3（A）可以看出，無水運輸過程中凡納濱對蝦的血糖濃度先升高后下降。新鮮狀態(tài)和短時冷擊后凡納濱對蝦的血糖濃度無顯著差異（P>0.05）；休眠5h血糖濃度升高，山梨醇組血糖濃度為對照組的69.5%，顯著低于對照組（P<0.05）；休眠10h對蝦血糖濃度降低，接近正常水平，山梨醇組仍顯著低于對照組（P<0.05）。凡納濱對蝦肝糖原含量的變化見圖3（B）。新鮮狀態(tài)時，對蝦的肝糖原含量為5.419mg/g，冷擊和休眠狀態(tài)時對蝦肝糖原含量下降，始終低于新鮮水平。休眠5h和10h，山梨醇組肝糖原含量均顯著低于對照組（P<0.05）。恢復(fù)1小時后，兩組對蝦肝糖原含量均回升，基本恢復(fù)正常狀態(tài)。

3討論

3.1山梨醇對呼吸代謝的影響SDH是三羧酸循環(huán)的第一個脫氫酶，是有氧呼吸的標(biāo)志酶。鰓要與水直接接觸才能發(fā)揮呼吸功能[15]。無水運輸過程中凡納濱對蝦暴露于空氣中，會損傷鰓上皮細(xì)胞等鰓結(jié)構(gòu)，擾亂對蝦正常攝取氧氣，造成缺氧脅迫。缺氧可調(diào)節(jié)對蝦體內(nèi)酶活力，使對蝦的主要代謝形式由有氧代謝轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧代謝[16]，還會刺激機體產(chǎn)生活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS），引起氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞[17]。無水運輸過程中，凡納濱對蝦在休眠的10小時內(nèi)，山梨醇組SDH活力始終高于對照組，推測這一階段山梨醇組對蝦有氧呼吸強度高，機體對氧氣攝取、運輸和利用的效率更高。LDH是生物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無氧呼吸的關(guān)鍵酶[18]，調(diào)節(jié)乳酸和丙酮酸的相互轉(zhuǎn)化參與能量代謝。乳酸是無氧代謝的終產(chǎn)物[19]，其含量常被用于評價動物的無氧代謝[20]。Maruo等[21]的研究表明，受到缺氧脅迫的羅氏沼蝦（Macrobrachiumrosenbergii）氧氣消耗量降低，血淋巴內(nèi)乳酸和CO2積累。試驗中對蝦休眠過程中，山梨醇組LDH活力和乳酸含量均高于對照組，說明此時對蝦無氧呼吸加速進行，代謝終產(chǎn)物在血液中積累。有研究發(fā)現(xiàn)甲殼動物從無水環(huán)境回到水環(huán)境時需要經(jīng)歷一個適應(yīng)過程。這與試驗兩組對蝦復(fù)蘇1小時后，LDH活力恢復(fù)到正常狀態(tài)，乳酸濃度略有下降但仍高于新鮮水平這一結(jié)論相符。對照組SDH活力在回到正常水環(huán)境后恢復(fù)緩慢、LDH活力在休眠過程中始終低于山梨醇組，可能是由于缺氧脅迫嚴(yán)重導(dǎo)致了部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損。凡納濱對蝦最終可能因鰓功能異常無法充分利用溶解氧，使代謝受阻，細(xì)胞內(nèi)離子代謝紊亂，破壞細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)而觸發(fā)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致對蝦死亡[22]。

3.2山梨醇對能量代謝的影響無水運輸過程中低溫和缺氧脅迫引起凡納濱對蝦生理代謝紊亂，造成供能不足[22]。缺氧條件下，LDH催化丙酮酸還原生成乳酸和少量能量。Holman等[23]發(fā)現(xiàn)，美人蝦（Lepidophthalmuslouisianensis）在缺氧的情況下能通過提高無氧代謝的強度，增加三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）的合成以滿足機體對能量的需求。本試驗中，山梨醇組在休眠狀態(tài)時SDH活力雖高于對照組，但低于新鮮狀態(tài)，有氧代謝產(chǎn)能可能不足以維持對蝦的代謝消耗。環(huán)境脅迫刺激凡納濱對蝦進行無氧代謝，生成的ATP能在一定程度上彌補因有氧代謝強度降低所導(dǎo)致的能量短缺[17]。山梨醇組的有氧呼吸和無氧呼吸強度高，意味著機體產(chǎn)生更多能量用于維持基本的代謝和其他生命活動，并有利于抵抗環(huán)境中持續(xù)出現(xiàn)的脅迫。血藍蛋白是甲殼動物血液中協(xié)助運輸氧的主要呼吸蛋白，占血淋巴總蛋白含量的60%~95%[24]。缺氧時加速合成血藍蛋白是甲殼動物的一種生理代償機制[25]。試驗中，凡納濱對蝦休眠過程中，兩組對蝦的血藍蛋白含量都呈上升趨勢，這與Taylor等[26]對無脊椎動物血藍蛋白動態(tài)變化的實驗結(jié)論，缺氧會加速血藍蛋白的合成一致。Cheng等[27]對羅氏沼蝦（Macro－brachiumrosenbergii）的研究指出環(huán)境氧濃度降低時，儲存在羅氏沼蝦肝胰腺囊泡中的預(yù)蛋白在ATP協(xié)助下迅速合成血藍蛋白，血藍蛋白含量及其氧親和力提高能增強機體對氧氣的吸收和利用能力[28]。Paschke等[29]關(guān)于捕蟹（Lithodessantolla）在低溶解氧下代謝的研究表示，捕蟹是通過調(diào)節(jié)氧合血藍蛋白的含量和激活無氧代謝，來加強自身對低氧環(huán)境的適應(yīng)能力。試驗中，山梨醇組對蝦呼吸代謝加強，加速ATP的生成。其中一部分ATP可能用于血藍蛋白的合成，進而增加血淋巴的氧容量，提高對蝦對氧氣的利用率，又在一定程度上促進有氧呼吸，形成良性循環(huán)的調(diào)節(jié)機制。葡萄糖是甲殼動物一般代謝過程中主要的能量底物，有氧條件下，機體通過三羧酸循環(huán)氧化分解葡萄糖釋放大量能量。動物體內(nèi)的糖類水平可以用于分析動物的能量代謝[30]，血糖濃度可于評價動物體所受生理應(yīng)激的強度[4]。低溫或缺氧等刺激容易導(dǎo)致動物血液內(nèi)葡萄糖含量快速升高[31]。Padinhare等[6]關(guān)于觀賞魚（Puntiusfilamentosus）的研究表明，運輸過程中低死亡率處理組的魚血糖濃度相對較低，表明該過程中魚體受到周圍環(huán)境的脅迫較小。根據(jù)Webster[32]的研究，黃道蟹（Cancerpagurus）血淋巴內(nèi)高血糖激素含量在其暴露于空氣的前1h~4h會迅速升高，造成癥急性缺氧和高血糖等脅迫。本試驗?zāi)M運輸?shù)倪^程中，山梨醇組對蝦的血糖濃度始終低于對照組，且變化幅度更為平穩(wěn)，沒有出現(xiàn)血糖過高的情況，說明該組受到的應(yīng)激脅迫較小，對氧氣的利用率提高，缺氧脅迫得到緩解。肝糖原在短期儲存和維持葡萄糖水平中有重要的作用[33]。Axelrod等[34]關(guān)于應(yīng)激激素的研究表明，在無水過程中溫度和氧氣含量等環(huán)境因素改變，會調(diào)節(jié)機體分泌激素，分解肝糖原，使血糖濃度升高。儲藏在肝胰腺的能量可以轉(zhuǎn)移到動物體內(nèi)其他組織用于生長和繁殖[35]。本試驗中凡納濱對蝦血糖濃度先增后降，肝糖原含量持續(xù)降低，可能是凡納濱對蝦受到低溫和缺氧刺激前期，動用肝糖原，以葡萄糖的形式釋放至血液中為機體供能。休眠后期，對蝦血糖濃度降低，可能是缺氧脅迫加劇，機體主要通過無氧代謝供能，血液中葡萄糖大量消耗所致。

4結(jié)論

山梨醇具有吸水保濕性，可以降低凡納濱對蝦體表液體的表面張力，有助于增加液體的擴散和滯留。在長時間無水過程中，山梨醇有助于保持凡納濱對蝦體表和鰓的濕潤，一定程度減少鰓絲等組織的失水損傷，保持呼吸上皮細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)和功能。降低鰓損傷程度有利于對蝦維持一定強度的氣體交換，提高血淋巴中的氧濃度，促進細(xì)胞中線粒體參與有氧代謝，為機體提供能量。山梨醇處理使凡納濱對蝦的呼吸和能量代謝更加充分，減少機體因缺氧和能量不足造成的代謝紊亂及細(xì)胞損傷，加強應(yīng)對無水和低溫脅迫的能力，提高凡納濱對蝦無水運輸?shù)拇婊盥省?/p>

作者：查蒙 管維良 茅林春 單位：浙江大學(xué)