快速發(fā)酵酒精技術(shù)可行性探析范文

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《甘蔗糖業(yè)雜志》2016年第5期

摘要：

將鮮釀酒酵母泥按不同的接種量接入糖蜜培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，研究表明隨著接種量的增大，酵母增殖系數(shù)減少、發(fā)酵周期縮短、發(fā)酵率略微降低。經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)，初始細(xì)胞數(shù)和最終細(xì)胞數(shù)的平均值與發(fā)酵周期的乘積K為常量，表明基于高密度細(xì)胞的糖蜜快速發(fā)酵酒精技術(shù)是一項(xiàng)可行并且十分有前景的技術(shù)。

關(guān)鍵詞：

高密度細(xì)胞；快速發(fā)酵；酒精

0前言

目前南方糖蜜酒精企業(yè)多采用固定化酵母雙濃度雙流加發(fā)酵工藝生產(chǎn)酒精[1-2]，常規(guī)做法是將固定化酵母放置于種子罐內(nèi)，流加15～20°Bx的稀糖蜜作為培養(yǎng)基，罐內(nèi)酵母濃度依據(jù)糖蜜質(zhì)量的優(yōu)劣程度可達(dá)0.8億～1.5億個(gè)/mL不等。近年來(lái)國(guó)家環(huán)保政策趨于嚴(yán)格，大部分糖廠的附屬酒精車間被叫停生產(chǎn)，各個(gè)糖廠的糖蜜被統(tǒng)一集中處理，糖蜜酒精生產(chǎn)模式由車間榨季性生產(chǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)橐?guī)模化常年連續(xù)生產(chǎn)。各種來(lái)源的糖蜜在運(yùn)輸過(guò)程中必然受到不同程度的污染，隨后被集中儲(chǔ)存在數(shù)千乃至上萬(wàn)立方米的大型儲(chǔ)罐長(zhǎng)達(dá)半年甚至2年之久。存儲(chǔ)期間，蛋白質(zhì)和還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)生氨基糖色素[3-4]；另外由于糖蜜黏度非常高，不易進(jìn)行滅菌，因此耐高滲微生物可將部分可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸，而這2類產(chǎn)物皆對(duì)酒精酵母產(chǎn)生很強(qiáng)的抑制作用，導(dǎo)致種子罐酵母細(xì)胞濃度處于1億個(gè)/mL左右的低水平，從而使得整體發(fā)酵周期延長(zhǎng)、生產(chǎn)效率低下。長(zhǎng)期以來(lái)，學(xué)者對(duì)接種量和酒精發(fā)酵速度有普遍共識(shí)：接種量小，發(fā)酵周期長(zhǎng)，出酒率相對(duì)高；接種量大，發(fā)酵周期短，出酒率相對(duì)低[5-7]，但是接種量和發(fā)酵周期具體有何種深層次的規(guī)律，至今鮮有報(bào)道。本文系統(tǒng)研究了酵母細(xì)胞濃度和發(fā)酵周期的關(guān)系，揭示了在一定范圍內(nèi)平均細(xì)胞數(shù)與發(fā)酵周期的乘積K為常量的規(guī)律，初步探索了高密度釀酒酵母細(xì)胞快速發(fā)酵酒精的可行性，為高濃糖蜜快速發(fā)酵酒精技術(shù)提供了理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

釀酒酵母，由廣東省生物工程研究所（廣州甘蔗糖業(yè)研究所）保藏；糖蜜，83.27°Bx，由廣東徐聞三和發(fā)展有限公司提供；種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母浸粉1.5%，蛋白胨2%，115℃、20min蒸汽滅菌；發(fā)酵培養(yǎng)基：30°Bx糖蜜，pH3.8，0.2%尿素，115℃、20min蒸汽滅菌。

1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器

MoxiZ細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，美國(guó)ORFLO公司；PAL-α迷你數(shù)顯折射儀，廣州愛(ài)宕科學(xué)儀器有限公司；BS201S電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；TDL-5A離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1鮮酵母培養(yǎng)收集方法

無(wú)菌條件下，挑一環(huán)新鮮斜面菌苔至小三角瓶種子培養(yǎng)基中，30℃、100r/min培養(yǎng)16～20h，再按10%的接種量接種至大三角瓶種子培養(yǎng)基，30℃、100r/min培養(yǎng)16～20h，離心分離收集菌泥備用。

1.3.2細(xì)胞計(jì)數(shù)方法

鮮酵母泥經(jīng)生理鹽水稀釋適當(dāng)倍數(shù)后用MoxiZ細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)量。由于脫水條件所限，經(jīng)測(cè)1g酵母泥含102億個(gè)細(xì)胞；發(fā)酵液細(xì)胞數(shù)則是取0.1～0.5mL，發(fā)酵液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后用MoxiZ細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)量。

1.3.3糖蜜發(fā)酵期間失重測(cè)量方法

精確稱量0.05、0.1、0.5、1g鮮酵母泥分別接種于100mL糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基中，給三角瓶套上發(fā)酵栓，靜止發(fā)酵，每隔2～6h搖勻并測(cè)失重，直至失重速率≤0.02g/(100mL•h)時(shí)發(fā)酵結(jié)束，記錄發(fā)酵時(shí)間，繪制失重曲線。

1.3.4糖蜜發(fā)酵期間細(xì)胞數(shù)和錘度測(cè)量方法

精確稱量0.05、0.1、0.5、1g鮮酵母泥分別接種于100mL糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基中，給三角瓶套上發(fā)酵栓，靜止發(fā)酵，每隔2～6h于無(wú)菌條件下取0.5mL測(cè)細(xì)胞數(shù)和錘度，直至錘度不再下降時(shí)發(fā)酵結(jié)束，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和錘度曲線。

2結(jié)果與討論

2.1接種量對(duì)糖蜜發(fā)酵失重、糖耗及細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

如圖1可知，隨著接種量的增大，發(fā)酵時(shí)間縮短，失重速率加快，0.05%、0.1%、0.5%、1%接種量分別在第68、58、31、20h時(shí)失重速率≤0.02g/(100mL•h)。如表1可知，隨著接種量增大，最終發(fā)酵失重略微下降，0.05%、0.1%、0.5%、1%接種量發(fā)酵組的最終失重量依次為7.42、7.3、7.2、7.12g，這是因?yàn)榻臃N量大、細(xì)胞基數(shù)也就越多，用于維持細(xì)胞生命活動(dòng)所消耗的能量就越多，所以用于轉(zhuǎn)化為酒精的糖相應(yīng)地減少，發(fā)酵率也略微下降。如圖2可知，隨著接種量的增大，糖耗速率加快，0.05%、0.1%、0.5%、1%接種量發(fā)酵組分別在第68、58、31、20h時(shí)錘度降到終點(diǎn)13°Bx左右，這個(gè)時(shí)間點(diǎn)和失重停止的時(shí)間點(diǎn)是相互對(duì)應(yīng)的，因?yàn)楦鶕?jù)葡萄糖酒精代謝反應(yīng)式，發(fā)酵失重量和酒精產(chǎn)量是成正比關(guān)系的。如圖3可知，隨著接種量增大，細(xì)胞生長(zhǎng)延滯期縮短，0.05%接種量發(fā)酵組延滯期長(zhǎng)達(dá)12h，而1%接種量發(fā)酵組則直接進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，0.05%、0.1%、0.5%、1%接種量發(fā)酵組進(jìn)入平穩(wěn)期的時(shí)間點(diǎn)依次為第40、32、16、8h，結(jié)合圖1發(fā)現(xiàn)這些時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的失重都為4.3g左右，間接反應(yīng)了發(fā)酵液累積產(chǎn)生的酒精到達(dá)一定濃度后便抑制酵母繁殖，據(jù)測(cè)量失重4.3g左右時(shí)對(duì)應(yīng)的酒精濃度約為6%(v/v)。

2.2接種量對(duì)酵母細(xì)胞增量和增殖系數(shù)的影響

如表1所示，4組不同接種量發(fā)酵組的細(xì)胞增量處于0.706億～0.734億個(gè)/mL，近乎于相等，所以細(xì)胞增殖系數(shù)也就隨接種量的增大而減少。酵母繁殖和發(fā)酵是同時(shí)進(jìn)行的，初始階段抑制酵母生長(zhǎng)的因素只有滲透壓，隨著發(fā)酵代謝活動(dòng)的進(jìn)行，產(chǎn)生的酒精累積到一定濃度便可抑制酵母生長(zhǎng)，此后階段酵母只能進(jìn)行發(fā)酵而不能繁殖。由此可知接種量大的發(fā)酵液組累積產(chǎn)生的酒精較先達(dá)到酵母生長(zhǎng)抑制濃度，與此同時(shí)接種量小的發(fā)酵液組還在繼續(xù)增殖，直至發(fā)酵酒分累積至細(xì)胞生長(zhǎng)抑制濃度，綜合細(xì)胞繁殖時(shí)間和細(xì)胞基數(shù)兩者對(duì)細(xì)胞增量的相互作用效果，推測(cè)各組的細(xì)胞增量可接近同一值。

2.3平均酵母數(shù)和發(fā)酵周期的關(guān)系

如表1所示，經(jīng)統(tǒng)計(jì)初始、最終細(xì)胞數(shù)、發(fā)酵周期各組數(shù)據(jù)，進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)4組接種量發(fā)酵組的平均酵母數(shù)和發(fā)酵周期的乘積K處于27～28，考慮計(jì)數(shù)誤差，K值可視作為常量，說(shuō)明平均酵母數(shù)和發(fā)酵周期成反比關(guān)系，隨著接種量增大，平均酵母數(shù)也增大，發(fā)酵周期則相應(yīng)地縮短，K值常量與此現(xiàn)象是吻合的，此發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)鮮有報(bào)道。

3結(jié)論與探討

目前國(guó)內(nèi)糖蜜酒精連續(xù)發(fā)酵一般有5～10級(jí)，種子罐兼作酵母培養(yǎng)罐和前發(fā)酵罐，酵母濃度0.8億～1.5億個(gè)/mL，酒度4%～6%(v/v)，后發(fā)酵罐經(jīng)過(guò)高濃糖蜜沖稀后酵母濃度只有0.5億～1億個(gè)/mL，一般種子罐發(fā)酵時(shí)間10h，后發(fā)酵時(shí)間30～40h。高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)非常成熟，筆者常年與廣東梅山—馬利酵母有限公司、廣東丹寶利酵母有限公司、廣西湘桂酵母科技有限公司合作，據(jù)了解采用高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)時(shí)細(xì)胞濕重可達(dá)到150～200g/L發(fā)酵液，細(xì)胞濃度可以達(dá)到20億～30億個(gè)/mL，如果采用高密度細(xì)胞發(fā)酵，根據(jù)K值理論發(fā)酵周期可縮短至10h以內(nèi)，也就是說(shuō)只需配備2～3個(gè)發(fā)酵罐，可大大減少設(shè)備和場(chǎng)地投資費(fèi)用，高密度細(xì)胞快速發(fā)酵亦可大幅增加酒精產(chǎn)能，是一項(xiàng)非常有市場(chǎng)前景的生物技術(shù)。

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作者:徐日益 尚紅巖 黃向陽(yáng) 梁磊 蘇江濱 陳啟球 單位:廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業(yè)研究所)廣東省甘蔗改良與生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省植物纖維綜合利用工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心 廣州市植物纖維綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省生物質(zhì)高值化利用工程實(shí)驗(yàn)室 廣東徐聞三和發(fā)展有限公司