茶樹CsANS基因的生物信息學(xué)分析范文

本站小編為你精心準(zhǔn)備了茶樹CsANS基因的生物信息學(xué)分析參考范文，愿這些范文能點(diǎn)燃您思維的火花，激發(fā)您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

《茶葉科學(xué)雜志》2016年第二期

摘要：

采用RACE技術(shù)，獲得茶樹武夷奇種C18葉片花青素合成途徑中的花青素合成酶（ANS）基因的cDNA全長(zhǎng)序列。采用染色體步移技術(shù)獲得該基因的啟動(dòng)子序列。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)該基因在不同遮光處理下的表達(dá)動(dòng)態(tài)。結(jié)果表明，csans全長(zhǎng)cDNA為1000bp，其中ORF（OpenReadingFrame）為957bp，編碼320個(gè)氨基酸，含有DIOX-N和20G-Fell-Oxy保守功能結(jié)構(gòu)域；分離得到CsANS基因上游調(diào)控序列1010bp，其含啟動(dòng)子核心元件TATA-box及ACE、GT1-motif、Sp1（光響應(yīng)元件）、circadian（生物鐘相關(guān)元件）等與花青素合成途徑相關(guān)的重要順式作用元件。熒光定量PCR分析表明，該基因在全光照處理（CK）時(shí)表達(dá)量較高，75%遮光時(shí)表達(dá)量較低。說明該基因的表達(dá)受光照強(qiáng)弱的控制。

關(guān)鍵詞：

茶樹；CsANS基因；啟動(dòng)子；生物信息學(xué)分析

茶樹武夷奇種C18，無性系。灌木型，中葉類，中生種。是福建省武夷山市茶葉研究所從武夷群體種中選育的優(yōu)良品系。芽葉紫紅色，茸毛較密，節(jié)稍長(zhǎng)。且芽葉生育力強(qiáng)，發(fā)芽較密，持嫩性較強(qiáng)，是一種稀有的特色茶樹資源。武夷奇種C18芽葉呈現(xiàn)紅紫色，花青素含量較高[1-2]。研究表明，花青素是茶樹葉片呈現(xiàn)“紅紫色”的主要原因[3]。植物花青素的生物合成途徑已有較為深入的研究，其中花青素合成酶（Anthocyaninsynthase，ANS）是將無色花青素經(jīng)氧化脫水形成紅紫色花青素的關(guān)鍵酶[1]。環(huán)境信號(hào)激活花青素合成途徑中相關(guān)基因的表達(dá)[4]。在花青素合成的前期，光能調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，弱光可以抑制或下調(diào)基因的表達(dá)，從而減少花青素的合成；而強(qiáng)光可以誘導(dǎo)花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)，使花青素的含量增加[5]。光信號(hào)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合的強(qiáng)弱，并影響結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，其表達(dá)量也會(huì)隨之發(fā)生相應(yīng)的變化[1]。目前在茶樹上，ANS基因的啟動(dòng)子還未克隆。本研究根據(jù)已有的茶樹ANS基因的EST（Expressedsequencetags）序列，采用同源克隆和GenomeWalking方法，克隆了紫葉茶樹的ANS基因及分離5′調(diào)控序列，再利用生物信息學(xué)法，預(yù)測(cè)了啟動(dòng)子的順式作用元件，采用熒光定量PCR技術(shù)，分析ANS在不同光照條件下的表達(dá)模式，有助于揭示ANS在紫色茶樹葉片對(duì)環(huán)境信號(hào)響應(yīng)過程中的作用，解析光強(qiáng)對(duì)武夷奇種C18ANS基因的調(diào)控機(jī)理，為紫芽茶樹特異種質(zhì)的創(chuàng)制和利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與處理1.1.1植物材料試驗(yàn)材料為武夷奇種C18，由福建省武夷山市茶葉研究所資源圃提供。選取武夷奇種C18的成熟葉片，迅速用液氮處理，置－80℃冰箱保存,用于基因組DNA的提取，克隆CsANS啟動(dòng)子序列。

1.1.2遮光處理試驗(yàn)在福建省武夷山市茶葉研究所資源圃中完成。2015年4月中旬，挑選生長(zhǎng)發(fā)育良好、整齊一致、樹形基本相似的植株27株，分為3組（每9株為1組，每重復(fù)3株），掛牌標(biāo)記，并對(duì)其進(jìn)行同一高度的修剪。待茶樹芽頭萌動(dòng)之時(shí)，開始遮光處理。設(shè)2個(gè)處理：分別用75%和60%的黑色遮蔭網(wǎng)遮光，以全光照處理為對(duì)照。經(jīng)過15d的遮光處理，取經(jīng)遮光處理和全光照處理（CK）的武夷奇種C18葉片（第一葉位），經(jīng)錫箔紙分裝于－80℃保存，用于熒光定量PCR檢測(cè)。

1.1.3試劑FHPlantDNAKit(北京德曼特爾生物科技有限公司)；PrimerStar(TaKaRa公司)；AgaroSeGelDNAExtractionKit(TaKaRa公司)；SMARTerRACE5′/3′Kit(TaKaRa公司)；染色體步移試劑盒(TaKaRa公司)；pEASY-BluntZeroCloningKit(福州都拜特生物技術(shù)有限公司)；引物合成及樣品測(cè)序由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司完成。

1.2方法

1.2.1茶樹葉片總RNA及基因組DNA的提取本試驗(yàn)參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取茶樹總RNA；采用FHPlantDNAKit(北京德曼特爾生物科技有限公司)試劑盒提取紫葉茶樹基因組DNA。

1.2.2茶樹CsANS5′RACE、3′RACE及全長(zhǎng)ORF的PCR擴(kuò)增cDNA第一鏈的合成按RevertAidTMFirst-StrandcDNASynthesisKi試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)已報(bào)道的擬南芥、葡萄、茶樹等ANS基因序列，用DNAMAN設(shè)計(jì)同源克隆引物。上游引物：5′-CAACAATGATGACTACAGTGGCTG-3′，下游引物：5′-GCGCCTTTAGAGCCAAGTTCTTG-3′。PCR擴(kuò)增體系：12.5µLEx-Taqmix，2µLcDNA模板，0.5µLANS-R，0.5µLANS-F，補(bǔ)ddH2O至25µL體系。94℃預(yù)變性4min，94℃變性40s，56℃退火30s，72℃延伸3min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在其ORF兩端設(shè)計(jì)特異引物qANS-R：5′-ATGGCTCTCTGTACATATGCATGTC-3′；qANS-F：5′-TTATACAATTGTTACACCCCCGGTC-3′擴(kuò)增全長(zhǎng)序列。

1.2.3CsANS基因啟動(dòng)子的克隆根據(jù)TaKaRaGenomeWalkingKit引物設(shè)計(jì)原則，在已知的茶樹ANS基因（GenBank收錄號(hào)為AY830416.1）的已知序列區(qū)（最好不少于500bp）分別設(shè)計(jì)3條反向且退火溫度較高的特異性引物SP1、SP2和SP3，再與試劑盒中提供的4種經(jīng)過獨(dú)特設(shè)計(jì)的退火溫度較低的兼并引物AP1、AP2、AP3和AP4進(jìn)行熱不對(duì)稱PCR反應(yīng)[6]，經(jīng)過3次巢式PCR反應(yīng)獲得已知序列的側(cè)翼序列。用于擴(kuò)增ANS基因啟動(dòng)子序列的特異性引物情況詳見表1。以提取的武夷奇種C18茶樹葉片DNA為模板，按照TaKaRaGenomeWalkingKit說明和林玉玲等[7]的方法進(jìn)行ANS基因啟動(dòng)子的克隆。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶克隆至pMD18-T載體，37℃連接過夜后進(jìn)行轉(zhuǎn)化測(cè)序（鉑尚生物技術(shù)有限公司）。

1.2.4熒光定量PCR表達(dá)分析分別提取遮光75%、60%和全光照處理（CK）的武夷奇種C18第一葉位總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋10倍作模板。以18S-rRNA基因?yàn)閮?nèi)參（18SⅠ：5′-CCTGAGAAACGGCTACCACA-3′，18SⅡ：5′-CACCAGACTTGCCCTCCA-3′）。運(yùn)用DNAMAN軟件，按照熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物（ANS-R：5′-GTTGCTGTAATAGGCGATGGTG-3′，ANS-F：5′-CCTGTTGGACTGTAATCTGCTAAG-3′）。參照SYBRPrimeScriptTMRT-PCRKit（TaKaRa）說明書，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增體系：cDNA模板1µL，2×SYBRPremixEx-TaqTM5µL，上下游引物（10µmol•L-1）各0.2µL，用RNase-freeH2O補(bǔ)足至10µL。95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃復(fù)性34s，共40個(gè)循環(huán)。每份樣品設(shè)3次重復(fù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用MicrosoftExcel2007軟件，采用2-ΔΔCt法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量[8]；應(yīng)用SPSS軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析。應(yīng)用MicrosoftExcel2007軟件作柱狀圖。

1.2.5生物信息學(xué)分析CsANS序列通過在線NCBI的Blast功能進(jìn)行氨基酸序列同源性比較；通過Protparam軟件對(duì)基因的分子量、等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，初步分析目的基因的功能；通過TMHMM和TMPred軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)；SignalP4.1進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；在線SOPMA預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。ProtCompVersion9.0進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。啟動(dòng)子序列通過在線PlantCAR[9]及Place軟件[10]預(yù)測(cè)其順式作用元件的種類、分布情況和生物學(xué)功能[11]。通過在線軟件BDGP[12]預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及可能的核心啟動(dòng)子區(qū)域。

2結(jié)果與分析

2.1茶樹CsANS基因cDNA全長(zhǎng)克隆

2.1.1茶樹CsANS基因PCR結(jié)果分析經(jīng)PCR擴(kuò)增回收測(cè)序及使用DNAman軟件拼接獲得CsANS基因全長(zhǎng)序列1000bp（GenBank收錄號(hào)為KT215319）。（圖1）該序列包含1個(gè)完整的閱讀框（15~977bp），編碼320個(gè)氨基酸，該基因含有起始密碼子ATG、終止密碼子TAA，并含有保守功能結(jié)構(gòu)域DIOX-N、20G-Fell-Oxy，屬于DIOX-N和20G-Fell-Oxy超級(jí)家族。

2.1.2茶樹CsANS基因的進(jìn)化分析將武夷奇種C18茶樹ANS基因的氨基酸序列與已知的茶樹、高叢越橘（Vacciniumcorymbosum）、和甘薯（Ipomoeabatatas）等11種植物ANS基因的氨基酸序列進(jìn)行同源進(jìn)化樹分析（圖3）。發(fā)現(xiàn)所克隆的ANS蛋白與同屬茶樹ANS蛋白（登錄號(hào)：AY830416.1）的一致性高達(dá)100%。與其他物種比較，發(fā)現(xiàn)茶樹ANS蛋白在親緣關(guān)系上與高叢越橘最近，同源性為78%。

2.1.3CsANS基因氨基酸生物信息學(xué)分析通過ProtParam軟件對(duì)CsANS氨基酸進(jìn)行基本信息分析可知，CsANS基因編碼320個(gè)氨基酸；相對(duì)分子量36113.6kD；理論等電點(diǎn)pI為6.23；負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）為46個(gè)，正電荷殘基（Arg+Lys）為43個(gè)；不穩(wěn)定指數(shù)為41.05，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂溶系數(shù)為：88.97，平均疏水性（GRAVY）為－0.397；分子式：C1626H2576N432O472S12，總原子數(shù)為5118，氨基酸組成中谷氨酸含量最高，占總氨基酸的10.3%；其次為甘氨酸，占6.9%，其他氨基酸占82.8%。利用在線軟件TMHMMServerv.2.0工具預(yù)測(cè)CsANS蛋白的跨膜螺旋區(qū)，如圖4顯示，該蛋白不是膜蛋白，無跨膜螺旋區(qū)。使用TMpred預(yù)測(cè)也顯示蛋白都分布在膜外，無跨膜蛋白。通過在線軟件COILS對(duì)CsANS氨基酸預(yù)測(cè)，在CsANS蛋白的25個(gè)氨基酸左右預(yù)測(cè)到強(qiáng)超螺旋信號(hào)。經(jīng)過SignalP-4.1預(yù)測(cè)信號(hào)肽顯示，CsANS編碼的氨基酸不含信號(hào)肽，不是分泌蛋白。對(duì)氨基酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示CsANS編碼的氨基酸中α螺旋結(jié)構(gòu)較多，有125個(gè)占所有氨基酸的39.06%，其次為無規(guī)則卷曲占31.87%，延伸鏈占17.81%，β折疊所占比例最低為11.25%。通過ProtCompVersion9.0軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，其亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)。

2.2CsANS基因啟動(dòng)子克隆

2.2.1CsANS基因啟動(dòng)子擴(kuò)增結(jié)果以武夷奇種C18的DNA為模板，經(jīng)3輪巢式PCR反應(yīng)后，擴(kuò)增到1條大于1000bp的目的片段（圖5）。將該片段進(jìn)行克隆、測(cè)序，結(jié)果顯示，獲得的片段實(shí)際長(zhǎng)度為1236bp。序列經(jīng)過分析整理后，以ATG為起始位點(diǎn)，得到茶樹CsANS上游長(zhǎng)度為1010bp的DNA序列。

2.2.2茶樹CsANS啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的預(yù)測(cè)經(jīng)過啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在線預(yù)測(cè)，茶樹CsANS基因1010bp的5′端調(diào)控序列可能存在3處核心啟動(dòng)子區(qū)域，位于35~85、316~366、480~530bp，分值分別為0.96、1和0.88，可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別為G、C和T。此結(jié)果可推測(cè)位于316~366bp的序列很可能就是該基因真正的核心啟動(dòng)子區(qū)域，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為位于第357bp的C（圖6）。

2.2.3茶樹CsANS基因啟動(dòng)子順式元件分析啟動(dòng)子生物學(xué)功能的在線預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CsANS基因啟動(dòng)子區(qū)域中，除了含有大量的核心啟動(dòng)子元件如CAAT-box和TATA-box之外，還存在多種順式元件，如脫落酸相關(guān)元件ABRE，厭氧誘導(dǎo)相關(guān)的元件ARE，熱應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)元件HSE，晝夜控制調(diào)節(jié)元件circadian，低溫應(yīng)答元件LTR，光響應(yīng)相關(guān)元件Sp1、ACE、I-box及MYB結(jié)合位點(diǎn)等（表2）。

2.3相對(duì)熒光定量PCR表達(dá)分析以18S-rRNA為內(nèi)參，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)不同遮光處理及未處理的武夷奇種C18葉片CsANS基因表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果（圖7）表明，其表達(dá)量在全光照處理（CK）時(shí)較高，75%遮光時(shí)較低。隨著遮光度增加，呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。說明茶樹葉片在光照強(qiáng)時(shí)花青素合成酶（ANS）表達(dá)量高，光照弱時(shí)表達(dá)量低。

3討論

CsANS是紫葉茶樹花青素合成的最后一個(gè)酶，也是將無色花青素經(jīng)氧化脫水形成紅紫色花青素的最關(guān)鍵酶，此中間產(chǎn)物進(jìn)一步與3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（3GT）偶聯(lián)并且被傳送到液泡中，形成顯色的3-O-糖苷化花青苷[13]，在植物色澤形成中具有重要作用[14]。ANS基因最初是利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)從玉米的A2突變體中鑒定和克隆得到[15]，近年來在茶樹（AY830416.1）、擬南芥（AT4G2288）、小麥（T.aestivum，AB247921）[16-17]等多種植物中也已經(jīng)得到其克隆。本研究從武夷奇種C18中克隆得到了CsANS的cDNA全長(zhǎng)序列，該基因編碼的蛋白具有典型ANS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域：DIOX-N、20G-Fell-Oxy。DIOX-N（嗎啡合成非血紅素加氧酶的N-末端）是蛋白質(zhì)與2-酮戊二酸/鐵（Ⅱ）依賴性雙加氧酶活性的高度保守的N-末端區(qū)域。2OG-FeⅡ_Oxy氧化酶結(jié)構(gòu)域由2-酮戊二酸和Fe(Ⅱ)-依賴的氧化酶超家族組成，該家族包括脯氨酰4-羥化酶α亞基的C末端。全酶由一個(gè)α2β2復(fù)合物組成，α亞基是其主要的活性位點(diǎn)。能夠催化反應(yīng)：前膠原L-脯氨酸+2-酮戊二酸+O2=前膠原反式-4-羥基-L-脯氨酸+琥珀酸+CO2[14]。與其他已知的ANS蛋白相比，CsANS編碼的氨基酸具有較高的同源性，它與高叢越橘（JN654701.1）的同源性較高，一致性為78%。所以推斷CsANS與高叢越橘中典型的花青苷元合成酶基因的生物學(xué)功能類似。環(huán)境信號(hào)激活花青素苷合成途徑，并促使茶樹葉片開始積累花青素[18-20]。

不同的外界環(huán)境因子下，葉色會(huì)隨之改變。光照是影響花青素苷合成最重要的環(huán)境因子之一。Hong等[21]對(duì)茶樹進(jìn)行暗光處理后發(fā)現(xiàn)ANS基因表達(dá)水平下降。Rosati等[17]從連翹中克隆得到ANS基因，并證明在Forsythin的花瓣中由于缺少ANS基因，所以形成無花色素苷。結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)可以看出：不同遮光處理及全光照處理的武夷奇種C18葉片中CsANS基因均有表達(dá)；全光照處理下，ANS基因表達(dá)量較高，75%遮光時(shí)較低，且遮光度增加，ANS基因表達(dá)量減少。這表明光照強(qiáng)時(shí)ANS基因表達(dá)量較高，光照弱時(shí)ANS基因表達(dá)量較低；CsANS基因?qū)τ谖湟钠娣NC18葉片色澤形成過程可能起主要作用，推斷與其基因的催化功能吻合。近年來ANS啟動(dòng)子在洋蔥（AlliumcepaL.）、三色堇（Viola×wittrockianaGams.）、紫心甘薯[Ipomoeabatatas(L.)Lam.]中已經(jīng)得到克隆[22-24]。洋蔥、紫心甘薯和三色堇的ANS啟動(dòng)子除含有多個(gè)CAAT-box、TATA-box等基本啟動(dòng)子元件外，還含有與MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的元件，以及參與光響應(yīng)、逆境、激素應(yīng)答的順式作用元件。這與本研究中武夷奇種C18的ANS啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)的順式作用元件相符，說明不同植物間ANS基因功能類似。武夷奇種C18的ANS啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了6種與光反應(yīng)調(diào)控有關(guān)的順式作用元件，結(jié)合CsANS基因在不同光強(qiáng)下表達(dá)量的變化，可以推測(cè)ANS是個(gè)受光照調(diào)控的基因。ANS基因在其他物種中參與光反應(yīng)的研究已有報(bào)道[25-26]，而從啟動(dòng)子角度來研究這類基因功能還鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)下一步可以構(gòu)建ANS基因的啟動(dòng)子缺失載體，轉(zhuǎn)化到植株中，通過光照處理研究該啟動(dòng)子是否為光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，確定啟動(dòng)子核心啟動(dòng)區(qū)，對(duì)光照調(diào)控ANS基因的原理加以闡釋。

作者：金琦芳 陳志丹 孫威江 林馥茗 薛志慧 黃艷 唐秀華 單位：福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院 福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院 閩臺(tái)特色作物病蟲害生態(tài)防控協(xié)同創(chuàng)新中心