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杜仲EucommiaulmoidesOliv．為杜仲科(Eucommiaceae)杜仲屬落葉喬木，為我國特產(chǎn)。杜仲皮是我國傳統(tǒng)的中藥材,具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎、降血壓等功效。杜仲傳統(tǒng)以皮入藥,然而杜仲皮的生產(chǎn)年限較長，一般20年左右才能剝皮，藥源遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要。近年來有關(guān)學(xué)者在杜仲以葉代皮方面做了不少研究［1，2］，發(fā)現(xiàn)杜仲葉與杜仲皮藥用成分的含量基本一致［2～4］，且藥效相當(dāng)，甚至有一些藥用成分，如綠原酸，其葉中的含量高于皮中含量的5倍［5］。因此，杜仲葉不僅可以作為杜仲的新藥源，而且可以作為保健品的新原料。綠原酸是杜仲葉中的重要成分［1，5］，具有利膽、抗菌、抗病毒、降壓、增高白血球及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理作用，是保健、醫(yī)藥等工業(yè)的重要原料［5～7］。杜仲葉中的綠原酸的含量常作為評價(jià)杜仲葉品質(zhì)的重要依據(jù)，而杜仲葉中綠原酸的產(chǎn)生與杜仲葉細(xì)胞發(fā)育有密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)在對杜仲葉結(jié)構(gòu)發(fā)育研究的基礎(chǔ)上，用HPLC方法測定了杜仲葉中綠原酸含量［8～10］，探索了杜仲葉中綠原酸含量與杜仲葉結(jié)構(gòu)發(fā)育之間的關(guān)系以及杜仲葉中綠原酸含量變化的規(guī)律，為杜仲葉的綜合開發(fā)利用及最佳采葉時(shí)期的確定提供科學(xué)依據(jù)。
1器材
1.1藥材本實(shí)驗(yàn)所用材料均取自河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物園地(東經(jīng)113°86''''、北緯35°31'''')。
1.2儀器和試藥儀器為美國Waters600高效液相色譜儀。Sep-pakC18柱，510泵，490可編程序紫外檢測器，680梯度裝置。綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所)。
2方法
2.1杜仲葉結(jié)構(gòu)的觀察從2006²04開始，每月取樣1次，直到落葉前的11月。用于測定綠原酸含量的杜仲葉采摘后在室內(nèi)自然風(fēng)干，粉碎備用。用于切片的材料，取后立即用3%戊二醛固定液固定并保存，常規(guī)石蠟切片制片法制片，番紅-固綠染色，Olympus顯微鏡觀察組織結(jié)構(gòu)，常規(guī)顯微測量。
2.2綠原酸的含量測定采用高效液相色譜法。
2.2.1色譜條件流動(dòng)相為乙腈（CH3CN）∶2%乙酸（HAC）水溶液（25∶75）；流速為1.0ml/min；檢測器波長分別為326nm,254nm；進(jìn)樣量1μl。
2.2.2綠原酸的測定精確稱取粉碎、過100目篩的杜仲葉樣品2g，加入150ml80%的甲醇水溶液，超聲波振蕩30min，抽濾，其濾液置于25ml容量瓶中，80%的甲醇水溶液定容。取出50ml放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸除甲醇，蒸至10～20ml轉(zhuǎn)至分液漏斗，以2N的鹽酸酸化，加醋酸乙酯20ml靜置分層，下層水相重復(fù)用醋酸乙酯萃取3次，合并醋酸乙酯，加無水Na2SO4脫水，濾除Na2SO4，濾液濃縮至干，然后加2ml甲醇溶液溶解，取0.2ml于活化的Sep-pakC18柱頂端，用80%的甲醇洗脫，收集前2ml洗脫液作樣品測定。
3結(jié)果
3.1杜仲葉生長發(fā)育中形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化杜仲葉橫切面觀察，杜仲葉片結(jié)構(gòu)屬于典型的中生性雙子葉植物葉結(jié)構(gòu)。葉片由表皮、葉肉和葉脈三部分組成。上表皮為一層細(xì)胞，排列緊密，長方形，外被角質(zhì)層；上表皮下面是柵欄組織，柵欄組織也由一層細(xì)胞組成，細(xì)胞呈長圓柱形；柵欄組織下方是由3～4層細(xì)胞組成的海綿組織，海綿組織細(xì)胞內(nèi)含有膠細(xì)胞，即海綿組織內(nèi)含有膠絲。海綿組織細(xì)胞下面是下表皮，下表皮也由一層扁平細(xì)胞組成，下表皮分布有較多氣孔。網(wǎng)狀葉脈，其中主脈維管束外韌型，形成層明顯。
杜仲葉的結(jié)構(gòu)在生長發(fā)育過程中隨著月份變化也在不斷變化(見表1)。4月份葉片厚度最小，角質(zhì)層也最薄，結(jié)構(gòu)分化不明顯，柵欄組織，海綿組織沒有分開，此后隨著時(shí)間推移，葉片厚度增加，柵欄組織厚度、海綿組織厚度以及角質(zhì)層的厚度都逐漸增加，到7月份各項(xiàng)指標(biāo)都達(dá)到最大，柵欄組織，海綿組織分化最明顯，而后直到11月份葉子落下都保持穩(wěn)定。柵欄組織與海綿組織厚度的比值也是在4月份最小，5月、6月份逐漸增大，7月份達(dá)到最大，以后趨于穩(wěn)定。表皮細(xì)胞所占葉片厚度的比例在4月份最大，以后逐漸變小，7月份以后趨于穩(wěn)定。
表1不同生長時(shí)期杜仲葉解剖結(jié)構(gòu)的特征（略）
3.2不同生長發(fā)育時(shí)期杜仲葉中綠原酸含量的變化葉片結(jié)構(gòu)的變化與化學(xué)成分的變化有著密切的關(guān)系。杜仲葉中的綠原酸的含量隨葉子生長而變化，在4～6月份綠原酸含量隨葉片的生長發(fā)育而增加，綠原酸在葉中含量的最大值出現(xiàn)在植株生長最旺盛的6月份，葉片中綠原酸含量達(dá)到最高為1.153%，比年平均含量高出33.0%，然后又隨著葉片生長進(jìn)入衰老階段，綠原酸含量逐漸下降，到葉落時(shí)達(dá)到最低為0.483%，比年平均含量低45.8%。結(jié)果見表2。
表24～11月份杜仲葉中綠原酸的含量（略）
4討論
杜仲是我國特有的經(jīng)濟(jì)樹種，在我國有大面積種植，每年杜仲葉產(chǎn)量約400萬t。本研究結(jié)果顯示，杜仲葉中含有豐富的杜仲皮指標(biāo)成分綠原酸，可以作為杜仲的新藥源和保健品的新原料。杜仲葉片結(jié)構(gòu)的發(fā)育與綠原酸含量的變化有著密切的關(guān)系。葉片發(fā)育早期，隨著柵欄薄壁組織、海綿薄壁組織等葉肉細(xì)胞的分化發(fā)育，杜仲葉片中綠原酸含量的不斷增加。6月葉片組織結(jié)構(gòu)發(fā)育成熟時(shí)葉片中綠原酸的含量達(dá)到最高。但此時(shí)采集葉片將嚴(yán)重影響杜仲樹生長。之后，隨著葉片的衰老，葉片中綠原酸的含量不斷降低，7～8月綠原酸降低較慢，9月之后綠原酸迅速降低，至落葉前（11月）葉片中綠原酸的含量最低。綜合分析葉片生物量和綠原酸的含量，7～8月份采集杜仲葉較合適。