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肝臟是機體主要的代謝器官,病毒性肝炎、毒物、藥物等諸多因素可導致肝功能受損而影響其正常的代謝功能。肝功能出現障礙時,對機體代謝產生的有害物質的清除能力下降,嚴重者甚至可引起肝昏迷。虎杖方劑由咸寧市南山肝病研究所歷經數年收集民間治療肝病驗方、經方、單方、秘方根據中醫理論由虎杖、地榆、三白草等配伍蓬莪術按一定比例成方,用于防治病毒性乙型肝炎。本方劑中虎杖、莪術均有保肝護肝作用[1,2]。近年來研究發現一氧化氮(NO)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等在肝損傷中起重要作用[3],并且發現莪術在較大劑量時對肝有毒性作用[4]。虎杖等對肝損傷時NO和TNF-α的影響尚未見報道。為了保證臨床用藥的安全性和有效性,本實驗就該方劑對四氯化碳致大鼠肝損傷的保護作用進行了觀察。
1材料與方法
1.1動物健康Wistar大鼠,體重180~250g,雌雄兼用。
1.2材料原生藥加蒸餾水浸泡1h后,煎煮1h和30min兩次,合并煎液進行濃縮,得濃度為含生藥100%的溶液,冰箱保存;四氯化碳(CCl4),分析純,上海申鶴化學品有限公司產品,臨用前用麻油配成50%的溶液;谷丙轉氨酶試劑盒、谷草轉氨酶試劑盒,上海生物制品研究所產品;SOD,MDA試劑盒,南京聚力生物醫學工程研究所產品;NO,TNF-α試劑盒,武漢博士德有限公司產品。
1.3實驗分組參照文獻[5]方法建立大鼠肝損傷模型,60只Wistar大鼠分成6組,每組10只。正常對照組以生理鹽水灌胃(1ml/kg,2次/d,連續6d);藥物對照組以藥物灌胃(1ml/kg,2次/d,連續6d);肝損傷組以50%CCl4灌胃(1ml/kg,1次/d,連續3d),第4天用生理鹽水灌胃(1ml/kg,2次/d,連續6d);藥物預防組為藥物灌胃(1ml/kg,2次/d,連續6d),第7天開始用50%CCl4灌胃(1ml/kg,1次/d,連續3d);藥物Ⅰ組以50%CCl4灌胃(1次/d)連續3d,第4d開始用藥物灌胃(1.0g/kg,2次/d,持續6d);藥物Ⅱ組以藥物灌胃2ml/kg,余同藥物Ⅰ組。
1.4生化測定與組織學觀察所有動物于末次處理后2h斷頭處死、取血、分離血清,按試劑盒說明用賴氏法測定血清丙氨酸轉氨酶(ALT)和天冬氨酸轉氨酶(AST)活性;用磷酸苯二鈉法測定血清堿性磷酸酶(AKP)活性;用酶聯吸附免疫法測定血清TNF-α水平;用硝酸還原酶法測定NO水平。同時取部分肝臟組織,用生理鹽水制成10%的組織勻漿,按試劑盒說明測定SOD活性及MDA含量,另取肝組織用10%多聚甲醛固定,石蠟包埋切片,HE染色,在光鏡下進行組織學觀察。
2結果
2.1虎杖方劑對CCl4肝損傷大鼠血清ALT,AST,AKP活性的影響肝損傷組血清ALT,AST及AKP水平明顯高于正常對照組(P<0.01),表明CCl4肝損傷模型制作成功。藥物對照組與正常對照組比較,血清酶活性無顯著性改變(P>0.05),提示在實驗給藥劑量時藥物本身不引起肝臟明顯損傷,對正常肝功能無明顯影響。無論預防性用藥還是治療性用藥,均顯著降低血清ALT,AST及AKP活性(P<0.01),其中以降低AST與ALT作用更明顯,結果表明藥物對CCl4肝損傷大鼠肝臟有保護作用。結果見表1。
表1虎杖方劑對大鼠血清ALT、AST及AKP活性的影響(略)
與正常對照組比較,1)P<0.01;與肝損傷組比較,2)P<0.01
2.2虎杖方劑對大鼠肝組織超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量的影響肝損傷組SOD水平顯著降低,MDA水平明顯升高,藥物治療組和預防組均明顯降低SOD水平,降低MDA水平,提示藥物能通過抑制脂質過氧化反應對肝臟產生保護作用,減輕CCl4對肝臟的損傷。結果見表2。
表2虎杖方劑對大鼠肝組織SOD活性及MDA含量的影響(略)
與正常對照組比較,1)P<0.01;與肝損傷組比較,2)P<0.01
2.3虎杖方劑對CCl4致肝損傷大鼠血清NO與TNF-α水平的影響與正常組比較,肝損傷組血清NO和TNF-α水平顯著增高,治療組或預防組血清NO和TNF-α水平均明顯降低,表明虎杖方劑保護CCl4引起的肝損傷與抑制NO合成和分泌,以及抑制TNF-α的表達有關,結果見表3。
表3虎杖方劑對CCl4致肝損傷大鼠血清NO與TNF-α水平的影響(略)
對照組比較,1)P<0.01;與肝損傷組比較,2)P<0.01,3)P<0.05
2.4虎杖方劑對CCl4致肝損傷的組織學觀察光鏡下觀察,肝損傷組肝小葉結構模糊,肝索排列紊亂,肝細胞腫脹明顯,胞漿疏松,大部分肝血竇變窄,甚至閉塞不通,有淤血改變,壞死范圍大,呈橋狀或帶狀壞死。藥物治療組和預防組,病變較肝損傷組明顯減輕,肝細胞輕度濁腫,病變僅限于肝小葉周邊區,呈點狀或局灶樣壞死,多數肝血竇顯露,開放通暢,內質網、線粒體等細胞器數目和形態恢復接近正常,肝細胞增生活躍,雙核多見。
3討論
四氯化碳是一種對肝細胞有嚴重毒性作用的化學物質,在體內經代謝產生自由基CCl3-,通過自由基介導的脂質過氧化作用破壞肝細胞器(如細胞膜、內質網、線粒體、溶酶體、細胞核),導致肝細胞變性壞死,轉氨酶大量漏出;同時四氯化碳可直接抑制肝臟微粒體混合功能酶[6,7](如CYP1A1、CYP1A2、CYP2B1和CYP2E1等),最終引起肝功能受損而降低。另外,在自由基的作用下,可激活單核細胞和巨噬細胞產生大量的細胞因子如腫瘤壞死因子(TNF-α)等,TNF-α參與炎癥反應直接損傷血管內皮細胞,導致內皮細胞功能紊亂。內皮細胞在一氧化氮合酶(NOS)的作用下合成并分泌內皮舒張因子一氧化氮(NO),合成NO的酶有兩種,即原生型和誘生型。原生酶合成的NO有舒張血管、傳遞信息、抑制血小板聚積等作用,而誘生酶合成的NO則與免疫及細胞毒有關,造成組壞死和細胞死亡,進一步加重肝損傷。有研究表明[3],誘導型NOS是肝臟的主要形式,并且TNF-α在肝臟炎癥反應中起非常重要的作用。
本實驗結果顯示,虎杖方劑能明顯對抗CCl4引起的大鼠肝損傷,其保肝護肝作用系通過虎杖中的白藜蘆醇苷和莪術中的莪術酮抗脂質過氧化、抑制TNF-α的表達和保護內皮細胞功能產生,與文獻報道的一致[8],而且該方劑本身對肝臟無明顯損傷作用。本實驗還觀察到預防給藥對肝臟雖有保護作用,但不及治療組,其原因系藥物在體內經代謝和消除而使藥效降低。