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1儀器與材料
顯微熔點(diǎn)測定儀(溫度計(jì)未校正)；AB-HS型質(zhì)譜儀；DRX-400型超導(dǎo)核磁共振儀，TMS為內(nèi)標(biāo)。3164型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國FORMA公司)；比色采用ThermoLabsystemsMultiskanMK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀。
藥材采于江西，由江西中醫(yī)學(xué)院賴學(xué)文副教授鑒定為瓜馥木Fissistigmaoldhamii（Hemsl.）Merr.，標(biāo)本存于廣東醫(yī)學(xué)院藥學(xué)教研室。
2方法與結(jié)果
2.1提取與分離瓜馥木根藥材經(jīng)粉碎后用乙醇加熱回流提取（3h×3次），合并濾液，減壓濃縮得總浸膏590g。浸膏用5%HCl捏溶處理后其酸不溶性部分用蒸餾水洗至中性，用水分散均勻，依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯進(jìn)行提取，回收溶劑得石油醚部分33.2g，氯仿部分63g，醋酸乙酯部分45.4g。氯仿部分反復(fù)進(jìn)行硅膠柱色譜，以三氯甲烷-甲醇為洗脫劑，得馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ化合物(15mg)。
2.2結(jié)構(gòu)鑒定采用化學(xué)和光譜的方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。該化合物與生物堿試劑反應(yīng)呈陽性，推測該化合物為生物堿。EI-MS給出分子離子m/z265(M+,100)，結(jié)合1H-NMR、13C-NMR，推斷分子式為C16H11NO3。UVλMeOHmaxnm:230,265,277；IRKBrmaxcm-1：3450，3251（羥基，NH），1691，1656(羰基)，1614，1502(苯環(huán))；EI-MS譜：265(M+,100)，250(M+-CH3,51)，222(M+-CH3-CO,18)，UV，IR，EI-MS的特征顯示該化合物屬于馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分［3］。1H-NMR顯示在δ4.04(3H,s)為一甲氧基信號；δ7.08～9.26ppm處有6個(gè)芳香質(zhì)子信號，其中δ9.26（1H,m），7.49（2H,m），7.77（1H,m）顯示出未取代的D環(huán)有4氫，H-5由于受3個(gè)環(huán)的去屏蔽作用，出現(xiàn)在最低場的δ9.26ppm處，可知δ7.49（2H,m）為H-6,H-7，δ7.77（1H,m）為H-8；δ7.08（1H,s）及7.68（1H,s）二個(gè)孤立芳香質(zhì)子信號顯示A、C環(huán)上各有一孤立芳香質(zhì)子，因此，A環(huán)中有兩個(gè)芳香質(zhì)子被取代。13C-NMR顯示在δ171.8ppm處為內(nèi)酰胺羰基信號,在δ150.7～107.1有14個(gè)芳碳信號，DEPT顯示有9個(gè)季碳、6個(gè)叔碳信號，δ57.4處為甲氧基。該化合物的UV，IR，1H-NMR，13C-NMR，EI-MS數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［3，4］中的馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ（AristolactamAⅡ）數(shù)據(jù)基本一致。因此，該化合物被鑒定為AristolactamAII，結(jié)構(gòu)式見圖1。
圖1瓜馥木中各化合物結(jié)構(gòu)式（略）
2.3樣品體外培養(yǎng)抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)
2.3.1實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為①空白組：每孔僅為1640培養(yǎng)液，在測光密度值（OD值）時(shí)用于調(diào)“0”；②對照組：每孔為含1640培養(yǎng)液稀釋的單細(xì)胞懸液；③實(shí)驗(yàn)組：又分1.00×103，1.00×102，10.00，1.00，0.10，1.00×10-2μmol·L-1馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ組，即每孔含1640培養(yǎng)液稀釋的單細(xì)胞懸液和不同濃度馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ。精密稱量馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ后用少量DMSO充分溶解，再用1640培養(yǎng)基稀釋成不同濃度備用。各組每孔溶液總體積均為200.00μl。
2.3.2MTT法檢測藥物的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)取已貼壁的GLC-82細(xì)胞，用質(zhì)量濃度為0.25%胰酶消化后，計(jì)數(shù)活細(xì)胞，用1640培養(yǎng)基稀釋成5×104/ml的單細(xì)胞懸液備用；取對數(shù)生長期的懸浮HL60細(xì)胞用1640培養(yǎng)基稀釋成1×105/ml的單細(xì)胞懸液備用。分別將兩種單細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，對照組每孔加單細(xì)胞懸液200.00μl，不同濃度實(shí)驗(yàn)組每孔加單細(xì)胞懸液190.00μl和不同濃度的馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ10.00μl；對照組和不同濃度實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞接種后置于37℃，100％相對濕度，含5％CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)48h；然后取出，仔細(xì)地吸去上清液，于每孔中加入150.00μlDMSO，輕輕振蕩以使甲臜完全溶解；約1h后于490nm波長處用酶標(biāo)儀測OD值。按抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%計(jì)算。采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間樣本均數(shù)采用Dunnett-t檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及分析結(jié)果見表1。并用Probit回歸法［5］估算半數(shù)抑制濃度（IC50值），馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ?qū)LC-82，HL60細(xì)胞的IC50分別為234.35，101.17μmol·L-1。
表1馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ?qū)LC-82及HL60細(xì)胞抑制的影響（略）
與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；n=4
3討論
本研究用MTT法研究發(fā)現(xiàn)：從瓜馥木中分離得到的單體化合物馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ堿對GLC-82細(xì)胞和HL60細(xì)胞均表現(xiàn)出一定的腫瘤抑制作用，且抑制作用隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)，作用強(qiáng)度與劑量呈一定的量效關(guān)系。
在低劑量1μmol·L-1以下時(shí)，馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ?qū)Ψ蜗侔〨LC-82細(xì)胞株的作用不明顯(P>0.05)，但對于白血病HL60細(xì)胞株抑制作用在劑量0.10μmol·L-1以上時(shí)作用明顯（P<0.01）。通過回歸計(jì)算的IC50分別為234.35，101.17μmol·L-1，其作用效果不同，表明馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ?qū)煞N細(xì)胞株有一定的選擇作用，作用機(jī)制尚須進(jìn)一步研究。
從瓜馥木中分離得到的O-甲基芒籽堿、氧代克斑寧等化合物對肺腺癌GLC-82細(xì)胞株亦有抗癌活性且作用強(qiáng)度相似（IC50分別為83.31，109.17μmol·L-1）［5］，但馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ的IC50為234.35μmol·L-1，其作用強(qiáng)度不同，可能與化合物的結(jié)構(gòu)類型有關(guān)（見圖1）。化合物O-甲基芒籽堿、氧代克斑寧為阿樸菲類型生物堿，馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ?yàn)轳R兜鈴內(nèi)酰胺類型生物堿，研究表明針對肺腺癌GLC-82細(xì)胞株，化合物的結(jié)構(gòu)母核起主導(dǎo)作用，各取代基團(tuán)對它的生物活性有一定的影響。初步構(gòu)效關(guān)系研究表明，阿樸菲類型的生物堿對肺腺癌GLC-82細(xì)胞株的毒性作用稍強(qiáng)。
瓜馥木中生物堿為瓜馥木抗炎、鎮(zhèn)痛作用主要有效成分［6］，MTT實(shí)驗(yàn)法表明瓜馥木中的生物堿亦具抗腫瘤活性作用，提示瓜馥木藥材值得深入研究。