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洋薊CynarascolymusL.又名朝鮮薊、菊薊、菜薊、荷蘭百合,為菊科菜薊屬多年生草本植物,原產(chǎn)地中海地區(qū)，20世紀(jì)90年代傳入我國，在浙江、云南等地有一定規(guī)模栽培［1］。洋薊有較高營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)洋薊葉中含有綠原酸、洋薊素、黃酮類化合物、天冬酰胺等成分，可促進(jìn)膽汁分泌，促進(jìn)氨基酸代謝，具有抗氧化、降低膽固醇、抗微生物等活性作用。用于治療消化不良、肝病等疾病［1］。
洋薊素（Cynarin）又稱洋薊酸，朝鮮薊酸，菜薊素，洋薊苷，1,3-二咖啡酰奎寧酸，是洋薊抗氧化、抗微生物作用的主要活性成分之一［2，3］。明確洋薊中的洋薊素含量，對于洋薊的食用、藥用成分等綜合開發(fā)有著重要的意義。目前,只有對洋薊中的綠原酸及天冬酰胺進(jìn)行含量測定的報(bào)道［4，5］，洋薊葉中的洋薊素含量測定國內(nèi)尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)就云南省引進(jìn)栽培的洋薊中洋薊素的提取及檢測分析方法進(jìn)行了初步研究，篩選并建立了快速、準(zhǔn)確測定洋薊素含量的反相高效液相色譜方法。
1儀器與試劑
日本島津SPD-10AT高效液相色譜儀：SPD-10Avp檢測器；SIL-10AP自動進(jìn)樣器；超純水器(arium611UF,Sartorius)；超聲波清洗器(AS3120A，天津瑞森特)；電子天平(AdventurerTM，AR2140，上海奧豪斯公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R-200,瑞士Buchi)。島津UV2100型紫外-可見光譜儀。
乙腈、甲醇為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，蒸餾水自制，其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。洋薊素對照品購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司（純度≥98%）。洋薊葉由昆明卡麥生物科技有限公司提供，栽種于云南省陸良縣。洋薊樣品由云南中醫(yī)學(xué)院楊禮攀副教授鑒定為菊科菜薊屬CynarascolymusL.的干燥葉。
2方法和結(jié)果
2.1色譜條件色譜柱為島津Shim-packCLC-ODS柱（150mm×6mm，5μm），流動相為乙腈-2%的醋酸水溶液（13∶87），流速1ml·min-1，檢測波長320nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量20μl。
2.2對照品溶液的制備稱取洋薊素適量，精密稱定，用流動相溶解，制成每毫升含洋薊素0.196mg的對照品儲備液,置于4℃的冰箱中避光保存。取對照品溶液適量，加流動相制成0.0049，0.0098,0.0196，0.049，0.098mg·ml-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。
2.3供試品溶液的制備取洋薊葉樣品粉末（洋薊葉陰干，粉碎過50目篩）約2.5g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入蒸餾水25ml,加熱回流提取30min（加熱溫度：85℃）,放冷濾過,藥渣加25ml蒸餾水,按上述方法回流再提取1次,濾液過濾后合并,濃縮蒸干,殘?jiān)恿鲃酉嗳芙?轉(zhuǎn)移至100ml棕色容量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,溶液經(jīng)0.45μm濾膜過濾,作為供試品溶液。色譜圖見圖1。
圖1HPLC色譜圖（略）
2.4線性關(guān)系和檢測限將“2.2”項(xiàng)下制好的系列濃度的對照品溶液分別進(jìn)樣20μl，以其組分峰面積Y對其質(zhì)量濃度X（mg·ml-1）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程：Y=6E+07X-1725.3，r=0.9998,線性范圍：0.0049～0.196mg·ml-1。將標(biāo)準(zhǔn)品溶液無限稀釋，測出檢出限為0.05μg·ml-1（S/N=3）。
2.5精密度實(shí)驗(yàn)將“2.2”項(xiàng)下制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.196mg·ml-1）按色譜條件平行測定5次，計(jì)算出洋薊素峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.93%,表明儀器精密度良好。
2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取樣品試液（“2.3”項(xiàng)方法配制）放置0，1，2，6，16，24h，分別按“2.1”色譜條件測定，測得洋薊素的峰面積RSD為1.20%。表明樣品放置24h穩(wěn)定。
2.7回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取已知含量的洋薊葉樣品粉末1.2g,加入一定量的洋薊素對照品液,按供試品制備測定方法操作,計(jì)算回收率，結(jié)果洋薊素平均回收率為98.12%，RSD為1.01%（n=5）。
2.8樣品的測定按“2.3”項(xiàng)方法制備的樣品溶液，采用上述色譜條件進(jìn)行分離,經(jīng)測定，洋薊葉樣品中洋薊素的含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為0.683%（n=3）。
3討論
3.1流動相的選擇由于洋薊素為有機(jī)酸,因此采用酸性流動相，實(shí)驗(yàn)中對甲醇-2%醋酸水溶液、乙腈-2%醋酸水溶液、乙腈-4%醋酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液流動相體系進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)乙腈-2%醋酸水溶液的分離效果較好，樣品中洋薊素峰形對稱并達(dá)到基線分離。最終選擇乙腈-2%醋酸水溶液（13：87）為流動相。
3.2檢測波長的選擇對洋薊素對照品溶液在200～450nm的范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，得到洋薊素的紫外吸收光譜，如圖2。從圖2中可看出洋薊素在220，295，320nm處出現(xiàn)3個(gè)吸收峰，考慮到在短波長處樣品中其他組分的干擾較大，最后選取320nm作為測定洋薊素的檢測波長。
3.3提取溶劑的選擇實(shí)驗(yàn)中比較了甲醇、乙醇、水、乙醇-水（40∶60）作為提取溶劑對提取效果的影響。結(jié)果顯示采用甲醇、乙醇、乙醇-水（40∶60）作為提取溶劑時(shí)，提取率不及水提取方法，且醇提取物雜質(zhì)多,測定時(shí)干擾較大,不利于色譜分離。因此選用水作為提取溶劑。
由于洋薊葉提取物具有良好的藥用價(jià)值，對多個(gè)系統(tǒng)疾病具有良好的治療作用,具有較好的開發(fā)前景。本研究采用HPLC法測定洋薊葉中洋薊素含量，方法快速、簡便、準(zhǔn)確，測定結(jié)果可靠，為洋薊在食品開發(fā)及醫(yī)藥應(yīng)用上提供了科學(xué)依據(jù)。