HPLC法檢測(cè)血清中伏立康唑含量范文

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【摘要】目的建立人體血清樣本中伏立康唑含量檢測(cè)方法。方法色譜柱為依利特C18柱（5μm，4.60mm×200mm）；流動(dòng)相為水：乙腈：冰醋酸：三乙胺＝64：36：0.1：0.05；流速：1.2ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng):258nm。結(jié)果伏立康唑在0.14～13.96μg/ml濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=0.998。結(jié)論實(shí)驗(yàn)建立的hplc方法可以用于血清樣本中的伏立康唑含量檢測(cè)。

【關(guān)鍵詞】伏立康唑血清樣本HPLC含量測(cè)定

【Abstract】ObjectiveToestablishamethodtodeterminatethevoriconazolecontentinhumanserumsamples.MethodsEliterC18column（200mm×4.6mm,5μm）wasusedwiththemobilephaseofwater-acetonitrile-aceticacid-triethylamine（64:36:0.1:0.05）.Theflowratewas1.2ml.min-1andthewave-lengthwas258nm.ResultsThecalibrationcurvewaslinearintherangeof0.14-13.96μg/ml（r=0.998）.ConclusionTheestablishedHPLCmethodcanbeusedinthedeterminationofvoriconazolecontentinhumanserum.

【Keywords】voriconazole;serumsample;HPLC;determination

伏立康唑（voriconazole,VRC）是一個(gè)三唑類抗真菌藥物，其作用機(jī)制是抑制真菌細(xì)胞色素p450依賴的14α-固醇脫甲基酶，而本品對(duì)于真菌細(xì)胞色素p450酶比對(duì)各種哺乳動(dòng)物的細(xì)胞色素p450酶系統(tǒng)更具選擇性。伏立康唑在0.03～64μg/ml的濃度范圍內(nèi)對(duì)幾乎所有的實(shí)驗(yàn)真菌，包括致病性酵母菌和絲狀菌屬及雙芽生菌的分離菌株均有作用。對(duì)一些條件致病真菌如曲霉菌屬、隱球菌屬及念珠菌屬包括對(duì)氟康唑耐藥的克柔念珠菌均有抗菌活性。本實(shí)驗(yàn)旨在建立血清樣本中伏立康唑濃度檢測(cè)方法。

1實(shí)驗(yàn)材料

伏立康唑?qū)φ掌罚袡z所提供。卡馬西平對(duì)照品，中檢所提供。乙腈：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心，批號(hào)：20051120。冰醋酸：分析純，天津市化學(xué)試劑三廠，批號(hào)：20061228。三乙胺：分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20040806。

Waters515高效液相泵，717自動(dòng)進(jìn)樣器，996紫外檢測(cè)器，Empower色譜工作站。

2色譜條件及血漿樣本處理方法［1～4］

2.1色譜條件色譜柱為依利特C18柱（5μm，4.60mm×200mm）；流動(dòng)相為水：乙腈：冰醋酸：三乙胺＝64：36：0.1：0.05；流速：1.2ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：258nm；柱溫：室溫。

2.2標(biāo)準(zhǔn)液制備精密稱取伏立康唑?qū)φ掌?.0340g，加甲醇溶解于50ml容量瓶中并稀釋至刻度,即得698μg/ml的伏立康唑?qū)φ掌啡芤骸＞芊Q取卡馬西平對(duì)照品0.0050g，用流動(dòng)相溶于100ml容量瓶中并稀釋至刻度，即得50μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3血漿樣品的處理取血漿0.2ml，內(nèi)標(biāo)10μl（卡馬西平50μg/ml），混勻，再加入0.5ml甲醇，旋渦振蕩0.5min，16000r/min離心5min;吸取上清液100μl進(jìn)樣。3方法學(xué)研究

3.1專屬性在選定的色譜條件下，伏立康唑與內(nèi)標(biāo)卡馬西平完全分離，且峰形良好，兩者保留時(shí)間分別約為8.4min和5.4min，空白血漿、空白血漿加藥物及內(nèi)標(biāo)、含藥血漿加內(nèi)標(biāo)按4法處理后，色譜圖見(jiàn)圖1。Ⅰ:空白血漿；Ⅱ:空白血漿加藥；Ⅲ:含內(nèi)標(biāo)血漿；IV：2號(hào)受試者用藥后2h色譜圖

A：卡馬西平,B：伏立康唑

圖1伏立康唑色譜圖3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程用伏立康唑?qū)φ掌啡芤海?98μg/ml）配制標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：將698μg/ml對(duì)照品溶液依次用流動(dòng)相稀釋，得到2.79、8.37、27.92、55.84、139.60、279.20μg/ml。

取空白血漿0.19ml分別置于系列試管中，分別加上述標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液各10μl，配制成血漿濃度為樣，按上0.14、0.42、1.40、2.79、6.98、13.96μg/ml的血漿標(biāo)述4方法處理血漿樣品，測(cè)定樣品及內(nèi)標(biāo)的峰面積，計(jì)算其峰面積比值（伏立康唑/卡馬西平，A），以峰面積比值A(chǔ)對(duì)血漿濃度C進(jìn)行線性回歸分析，求得線性回歸方程為：C=5.117A+0.024（w=1/cc），r=0.998。結(jié)果表明，伏立康唑血漿濃度在0.14～13.96μg/ml濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，血漿樣品可進(jìn)行定量檢測(cè)的最低濃度為0.14μg/ml。見(jiàn)圖2。

圖2伏立康唑血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3絕對(duì)回收率各取空白血漿0.19ml于15個(gè)空白試管中，5個(gè)為一組，分別加入8.37μg/ml（低濃度）、55.84μg/ml（中濃度）、139.60μg/ml（高濃度）伏立康唑?qū)φ掌啡芤?0μl。得濃度為0.42μg/ml、2.79μg/ml、6.98μg/ml的血漿樣品。按上述4方法處理血漿樣品，進(jìn)樣100μl，記錄色譜峰面積。

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bsp;另外，用純水代替血漿重復(fù)以上步驟，記錄色譜峰面積。以此為標(biāo)準(zhǔn)，將兩組峰面積進(jìn)行比較，計(jì)算伏立康唑的絕對(duì)回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.4相對(duì)回收率試驗(yàn)各取空白血漿0.19ml于15個(gè)空白試管中，5個(gè)為一組，分別加入8.37μg/ml、55.84μg/ml、139.60μg/ml伏立康唑?qū)φ掌啡芤?0μl，得濃度為0.42μg/ml、2.79μg/ml、6.98μg/ml的血漿樣品。按上述4方法處理血漿樣品，進(jìn)樣100μl，記錄色譜峰面積的比值。將比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，與理論值進(jìn)行比較，計(jì)算伏立康唑的相對(duì)回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.5精密度試驗(yàn)取空白血漿0.19ml置于離心管中，分別加入已配制好的8.37μg/ml、55.84μg/ml、139.60μg/ml伏立康唑?qū)φ掌啡芤焊?0μl，按上述4血漿樣品處理方法處理后，得血漿濃度為0.42μg/ml、2.79μg/ml、6.98μg/ml的血漿標(biāo)樣各15份，按上述4方法處理血漿樣品，于同日和連續(xù)2日內(nèi)各進(jìn)樣100μl，測(cè)定樣品和內(nèi)標(biāo)的峰面積，計(jì)算其峰面積比值（A），并按回歸方程求出對(duì)應(yīng)濃度，以此計(jì)算其日內(nèi)和日間變異，結(jié)果見(jiàn)表2。表1回收率試驗(yàn)表2精密度試驗(yàn)

3.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取空白血漿0.19ml置于離心管中，分別加入已配制好的8.37μg/ml、55.84μg/ml、139.60μg/ml伏立康唑?qū)φ掌啡芤焊?0μl，得血漿濃度為0.42μg/ml、2.79μg/ml、6.98μg/ml的血漿標(biāo)樣各20份，分別于配制后立即、室溫放置4h后，24h后反復(fù)凍融三次和1個(gè)月后，按上述4血漿樣品處理方法處理，測(cè)定樣品和內(nèi)標(biāo)的峰面積，計(jì)算其峰面積比值（A），并按回歸方程求出對(duì)應(yīng)濃度并比較測(cè)定濃度，以考察樣品穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)表3。

4結(jié)果

測(cè)定血清樣品中均勻加入低、中、高對(duì)照樣品，以評(píng)價(jià)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。配制方法：取空白血漿0.19ml置于離心管中分別加入已配制好的8.37μg/ml、55.84μg/ml、139.60μg/ml伏立康唑?qū)φ掌啡芤焊?0μl，得血漿濃度為0.42μg/ml、2.79μg/ml、6.98μg/ml的血漿標(biāo)樣，按上述4血漿樣品處理方法處理后，進(jìn)樣100μl，結(jié)果見(jiàn)表4。

5結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立起的HPLC檢測(cè)伏立康唑血清樣本含量的方法可行，檢測(cè)的數(shù)據(jù)真實(shí)可靠，可以作為血清樣本中伏立康唑含量測(cè)定方法。表3樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)表4血清樣品中伏立康唑檢測(cè)結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】

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