黃磷亞砷酸鈉亞急性肝損害大鼠肝臟酶組織化學定量Ⅰ線粒體標志酶變化范文

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關鍵詞：黃磷；亞砷酸鈉；毒性；肝疾?。唤M織細胞化學；酶學；疾病模型，動物；大鼠

在中毒性肝損害中線粒體作為毒物作用的“靶細胞器”，對各種毒物非常敏感，其生化功能首先受到干擾，最后導致其結構破壞［1，2］。鎂ATP酶(Mg2+-ATPase)，單胺氧化酶(MAO)，琥珀酸脫氫酶(SDH)，細胞色素氧化酶(CO)作為線粒體內外膜標志酶，經組織化學(組化)方法原位顯示酶的活性，并定量觀察中毒性肝損害時酶活性的動態變化對評價毒物的毒理作用及各種毒物不同的作用特點具有重要意義。本研究通過對黃磷，亞砷酸鈉中毒大鼠肝臟上述酶的組化染色，利用圖像分析技術對肝小葉各區帶酶活性定量測定，并結合光鏡及電鏡下毒物結構損害的特點［3］，探討黃磷和砷肝損害的酶學特點及其中毒機制。

1材料與方法

1.1試劑與儀器ATP二鈉鹽(中科院上海生化研究所)；丁二酸鈉(上海試劑一廠)；細胞色素C(Sigma公司)；鹽酸色氨(Serva公司)；氯化硝基四氮唑藍(上海前進試劑廠)；二氨基聯苯胺(Sigma公司)；Histostat低溫冷凍切片機(美國)；圖像分析儀(德國)。

1.2動物分組與染毒方式健康雄性大鼠90只，體重(267±32)g，常規飼養，隨機分為三組，每組30只。黃磷(P組)1.5mg/kg溶于芝麻油，亞砷酸鈉(As組)20mg/kg，溶于水；大鼠灌胃染毒，劑量為每100g體重0.2ml，每周三次，連續12周。對照組給予等體積的芝麻油。

1.3酶組化及圖像分析方法染毒后每2周各組隨機抽取大鼠5只，放血處死。取出肝臟立即在右肝正中切取5mm×5mm×3mm組織塊，“AO”低溫冷凍切片機在-15℃下切成10μm厚切片。繼而入新配制的孵育液作孵育等系列處理，甘油明膠封片。同時作去底物空白對照。Mg2+-ATPase，SDH，CO，MAO組化均采用經典方法［4］，并經本研究室改良。標本次晨作圖像分析處理。在熒光屏直視下劃出肝小葉及其區帶。該圖像分析以光密度(OD)值表示染色的深線，光密度值大表示酶活性高。中央靜脈區參數為OD1，中間帶為OD2，周圍帶為OD3，全小葉為ODt。各組選取第2，4，10，12周標本5只，每一標本隨機取5個視野。所得參數由計算機作統計處理，多樣本均數的兩兩比較用方差分析，方差不齊者用秩和檢驗。

2結果

2.1Mg2+-ATPase的變化該酶活性主要位于肝小葉周圍帶，反應顆粒呈棕褐色點狀和線狀(封四圖1)。砷染毒早期(2～4周)，OD1酶活性增高(封四圖2)；黃磷組則各區帶酶活性下降(封四圖3)，其后(10～12周)兩組酶活性均下降。詳見附表。

與對照組同期比較：1)P＜0.05；P＜0.01

2.2SDH的變化對照組反應為紫藍色甲顆粒，主要定位于肝小葉OD3，OD1相對較低，P，As染毒后，酶活性普遍下降(各時間組ODt與對照組比較，P＜0.05)，但OD1酶活性均無明顯影響(P＞0.05)。

2.3MAO的變化反應物為紫色，對照組主要分布在周圍帶。P，As染毒后ODt和OD3下降明顯，但As組12周較10周酶活性增高(41.27±5.976vs35.17±9.254，P＜0.05)。

2.4CO的變化反應物為棕色顆粒，對照組主要位于肝小葉周圍帶，從中央帶到周圍帶酶活性梯度遞增。在染毒早期(2～4周)各區帶酶活性無明顯變化。P組10～12周OD3活性下降(P＜0.05～0.01)，As組12周OD1酶活性增高(40.42±8.607vs32.48±8.896)，P＜0.01)，其它區帶變化不明顯。

3討論

3.1肝小葉中酶活性的正常分布及意義經典肝小葉作為一古老概念，由于光鏡下邊界清楚，現仍用于教學和科研中。“肝腺泡”的引入無疑對肝功能的結構基礎解釋更為完善，對肝臟病理和毒理研究有重大意義［5］。將肝小葉分為三個區帶，基本上與肝腺泡結構吻合。小葉中央帶相當于6個單腺泡的第Ⅲ帶；周圍帶相當于6個單腺泡的第Ⅰ帶，只是門管區周圍包括了腺泡3個帶的部分肝細胞。肝小葉周圍帶集中大量的線粒體，其標志酶含量極豐富，是生物氧化過程的主要場所；也最先接觸毒物。而中央帶富含混合功能氧化酶［6］，是藥物(毒物)代謝的場所，肝細胞營養條件差，最受到藥物(毒物)的損害。

3.2黃磷、砷對肝酶系統的損害特點及其機制Mg2+-ATPase活性主要分布在膽小管，其次為線粒體，核膜及質膜。本組砷染毒2周，中央帶Mg2+-ATPase，活性增高，第4周更為明顯；10周開始回落，12周酶活性下降明顯；而周圍帶持續下降。光鏡下發現，2～4周中央帶肝細胞濁腫變性；電鏡下線粒體腫脹，嵴膜完整清晰，膽小管輕度擴張，10周線粒體基底密度降低，部分膜破裂［3］。此時，光鏡下可見點狀壞死，炎性細胞浸潤。提示砷中毒早期，膽小管及線粒體Mg2+-ATPase活性代償性增強。而砷中毒早期，砷的排泄除腎外，主要經膽道由糞便排出，因此，Mg2+-ATPase活性增強可能是機體中毒早期的一種解毒機制。以后隨著膽小管和線粒體結構的破壞、酶活性降低。黃磷對Mg2+-ATPase的損害無選擇性，各區帶酶活性下降程度大于砷組。光鏡下，2周即出現細胞脂變，10周出現小片狀壞死；電鏡下胞質含有大量脂滴及次級溶酶體，部分線粒體膜破壞、嵴溶解［3］，說明脂質過氧化作用損害了線粒體及其它生物膜結構。同樣，黃磷也使周圍帶MAO，SDH活性下降，與張弘［2］報道的酶學變化相吻合。

然而，黃磷和砷對中央帶SDH無明顯影響則可能是OD1區SDH分布量甚少或毒物對其不敏感之故。砷作為氧化磷酸化的解偶聯劑，對琥珀酸介導的呼吸無明顯影響［7］。砷組晚期MAO活性有回升則可能為細胞對砷產生耐受后酶活性部分恢復所致。黃磷組僅晚期外周帶CO活性下降，結合上述結構改變，考慮為中毒早期CO對黃磷不敏感。砷中毒晚期中央帶CO活性增高，可能是砷干擾了線粒體氧化的“外途徑”，從而激活了“內途徑”使CO活性增高以滿足ATP生成的需要［8］。

此外，從光鏡及酶組化發現：同一個體肝臟一定部位，中毒后不同的肝小葉其結構及酶活性損害程度不同。同一小葉不同區帶其損害也不盡相同。電鏡下還觀察到，同一區帶內不同的肝細胞其結構損害差異亦很大。這種差異性，說明了肝細胞生理功能與細胞結構內在

聯系的復雜性，其組織學及病理學意義有待進一步探討。

參考文獻

1劉起展.黃磷引起肝臟損害機理及部位的研究.遵義醫學院學報，1991，(1)：10～14

2張弘.砷、磷、四氯化碳肝損害酶學指標的比較研究.中華勞動衛生職業病的雜志，1991，(1)：26～29

3詹道友，盧迪生，韓英士，等.黃磷、砷肝損害的電鏡和微體酶細胞化學比較研究.湖南醫科大學學報，1993，18(3)：243～246

4陳嘯梅.組織化學手冊.北京：人民衛生出版社，1982.128

5顧長海.肝腺泡學說的概念及其意義.國外醫學*消化分冊，1984，4(2)：79

6湯平濤.磷、砷、四氯化碳肝損傷線粒體和微粒體乳酸脫氫酶同工酶的改變.中國藥理學與毒理學雜志，1992，(4)：292～296

7FowlerBA.Ultrastructuralandbiochemicaleffectsofprolongedoralarsenicexposureonlivermitochondriaofrat.EnvironHealPersp,1977,19:197～204

8FowlerBA.KineticalterationsofcytochromeCoxidaseincarbontetrachlorideinducedcirrhoticratliver.LifeSciences,1987,41(6):741～748新晨