黃磷亞砷酸鈉亞急性肝損害大鼠肝臟酶組織化學(xué)定量Ⅰ線粒體標(biāo)志酶變化范文

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關(guān)鍵詞：黃磷；亞砷酸鈉；毒性；肝疾??；組織細(xì)胞化學(xué)；酶學(xué)；疾病模型，動物；大鼠

在中毒性肝損害中線粒體作為毒物作用的“靶細(xì)胞器”，對各種毒物非常敏感，其生化功能首先受到干擾，最后導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)破壞［1，2］。鎂ATP酶(Mg2+-ATPase)，單胺氧化酶(MAO)，琥珀酸脫氫酶(SDH)，細(xì)胞色素氧化酶(CO)作為線粒體內(nèi)外膜標(biāo)志酶，經(jīng)組織化學(xué)(組化)方法原位顯示酶的活性，并定量觀察中毒性肝損害時酶活性的動態(tài)變化對評價毒物的毒理作用及各種毒物不同的作用特點具有重要意義。本研究通過對黃磷，亞砷酸鈉中毒大鼠肝臟上述酶的組化染色，利用圖像分析技術(shù)對肝小葉各區(qū)帶酶活性定量測定，并結(jié)合光鏡及電鏡下毒物結(jié)構(gòu)損害的特點［3］，探討黃磷和砷肝損害的酶學(xué)特點及其中毒機制。

1材料與方法

1.1試劑與儀器ATP二鈉鹽(中科院上海生化研究所)；丁二酸鈉(上海試劑一廠)；細(xì)胞色素C(Sigma公司)；鹽酸色氨(Serva公司)；氯化硝基四氮唑藍(lán)(上海前進試劑廠)；二氨基聯(lián)苯胺(Sigma公司)；Histostat低溫冷凍切片機(美國)；圖像分析儀(德國)。

1.2動物分組與染毒方式健康雄性大鼠90只，體重(267±32)g，常規(guī)飼養(yǎng)，隨機分為三組，每組30只。黃磷(P組)1.5mg/kg溶于芝麻油，亞砷酸鈉(As組)20mg/kg，溶于水；大鼠灌胃染毒，劑量為每100g體重0.2ml，每周三次，連續(xù)12周。對照組給予等體積的芝麻油。

1.3酶組化及圖像分析方法染毒后每2周各組隨機抽取大鼠5只，放血處死。取出肝臟立即在右肝正中切取5mm×5mm×3mm組織塊，“AO”低溫冷凍切片機在-15℃下切成10μm厚切片。繼而入新配制的孵育液作孵育等系列處理，甘油明膠封片。同時作去底物空白對照。Mg2+-ATPase，SDH，CO，MAO組化均采用經(jīng)典方法［4］，并經(jīng)本研究室改良。標(biāo)本次晨作圖像分析處理。在熒光屏直視下劃出肝小葉及其區(qū)帶。該圖像分析以光密度(OD)值表示染色的深線，光密度值大表示酶活性高。中央靜脈區(qū)參數(shù)為OD1，中間帶為OD2，周圍帶為OD3，全小葉為ODt。各組選取第2，4，10，12周標(biāo)本5只，每一標(biāo)本隨機取5個視野。所得參數(shù)由計算機作統(tǒng)計處理，多樣本均數(shù)的兩兩比較用方差分析，方差不齊者用秩和檢驗。

2結(jié)果

2.1Mg2+-ATPase的變化該酶活性主要位于肝小葉周圍帶，反應(yīng)顆粒呈棕褐色點狀和線狀(封四圖1)。砷染毒早期(2～4周)，OD1酶活性增高(封四圖2)；黃磷組則各區(qū)帶酶活性下降(封四圖3)，其后(10～12周)兩組酶活性均下降。詳見附表。

與對照組同期比較：1)P＜0.05；P＜0.01

2.2SDH的變化對照組反應(yīng)為紫藍(lán)色甲顆粒，主要定位于肝小葉OD3，OD1相對較低，P，As染毒后，酶活性普遍下降(各時間組ODt與對照組比較，P＜0.05)，但OD1酶活性均無明顯影響(P＞0.05)。

2.3MAO的變化反應(yīng)物為紫色，對照組主要分布在周圍帶。P，As染毒后ODt和OD3下降明顯，但As組12周較10周酶活性增高(41.27±5.976vs35.17±9.254，P＜0.05)。

2.4CO的變化反應(yīng)物為棕色顆粒，對照組主要位于肝小葉周圍帶，從中央帶到周圍帶酶活性梯度遞增。在染毒早期(2～4周)各區(qū)帶酶活性無明顯變化。P組10～12周OD3活性下降(P＜0.05～0.01)，As組12周OD1酶活性增高(40.42±8.607vs32.48±8.896)，P＜0.01)，其它區(qū)帶變化不明顯。

3討論

3.1肝小葉中酶活性的正常分布及意義經(jīng)典肝小葉作為一古老概念，由于光鏡下邊界清楚，現(xiàn)仍用于教學(xué)和科研中。“肝腺泡”的引入無疑對肝功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)解釋更為完善，對肝臟病理和毒理研究有重大意義［5］。將肝小葉分為三個區(qū)帶，基本上與肝腺泡結(jié)構(gòu)吻合。小葉中央帶相當(dāng)于6個單腺泡的第Ⅲ帶；周圍帶相當(dāng)于6個單腺泡的第Ⅰ帶，只是門管區(qū)周圍包括了腺泡3個帶的部分肝細(xì)胞。肝小葉周圍帶集中大量的線粒體，其標(biāo)志酶含量極豐富，是生物氧化過程的主要場所；也最先接觸毒物。而中央帶富含混合功能氧化酶［6］，是藥物(毒物)代謝的場所，肝細(xì)胞營養(yǎng)條件差，最受到藥物(毒物)的損害。

3.2黃磷、砷對肝酶系統(tǒng)的損害特點及其機制Mg2+-ATPase活性主要分布在膽小管，其次為線粒體，核膜及質(zhì)膜。本組砷染毒2周，中央帶Mg2+-ATPase，活性增高，第4周更為明顯；10周開始回落，12周酶活性下降明顯；而周圍帶持續(xù)下降。光鏡下發(fā)現(xiàn)，2～4周中央帶肝細(xì)胞濁腫變性；電鏡下線粒體腫脹，嵴膜完整清晰，膽小管輕度擴張，10周線粒體基底密度降低，部分膜破裂［3］。此時，光鏡下可見點狀壞死，炎性細(xì)胞浸潤。提示砷中毒早期，膽小管及線粒體Mg2+-ATPase活性代償性增強。而砷中毒早期，砷的排泄除腎外，主要經(jīng)膽道由糞便排出，因此，Mg2+-ATPase活性增強可能是機體中毒早期的一種解毒機制。以后隨著膽小管和線粒體結(jié)構(gòu)的破壞、酶活性降低。黃磷對Mg2+-ATPase的損害無選擇性，各區(qū)帶酶活性下降程度大于砷組。光鏡下，2周即出現(xiàn)細(xì)胞脂變，10周出現(xiàn)小片狀壞死；電鏡下胞質(zhì)含有大量脂滴及次級溶酶體，部分線粒體膜破壞、嵴溶解［3］，說明脂質(zhì)過氧化作用損害了線粒體及其它生物膜結(jié)構(gòu)。同樣，黃磷也使周圍帶MAO，SDH活性下降，與張弘［2］報道的酶學(xué)變化相吻合。

然而，黃磷和砷對中央帶SDH無明顯影響則可能是OD1區(qū)SDH分布量甚少或毒物對其不敏感之故。砷作為氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑，對琥珀酸介導(dǎo)的呼吸無明顯影響［7］。砷組晚期MAO活性有回升則可能為細(xì)胞對砷產(chǎn)生耐受后酶活性部分恢復(fù)所致。黃磷組僅晚期外周帶CO活性下降，結(jié)合上述結(jié)構(gòu)改變，考慮為中毒早期CO對黃磷不敏感。砷中毒晚期中央帶CO活性增高，可能是砷干擾了線粒體氧化的“外途徑”，從而激活了“內(nèi)途徑”使CO活性增高以滿足ATP生成的需要［8］。

此外，從光鏡及酶組化發(fā)現(xiàn)：同一個體肝臟一定部位，中毒后不同的肝小葉其結(jié)構(gòu)及酶活性損害程度不同。同一小葉不同區(qū)帶其損害也不盡相同。電鏡下還觀察到，同一區(qū)帶內(nèi)不同的肝細(xì)胞其結(jié)構(gòu)損害差異亦很大。這種差異性，說明了肝細(xì)胞生理功能與細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)在

聯(lián)系的復(fù)雜性，其組織學(xué)及病理學(xué)意義有待進一步探討。

參考文獻(xiàn)

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3詹道友，盧迪生，韓英士，等.黃磷、砷肝損害的電鏡和微體酶細(xì)胞化學(xué)比較研究.湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1993，18(3)：243～246

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