無定形磷酸鈣負(fù)載rhBMP2納米緩釋體制備及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)范文

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【摘要】制備無定形磷酸鈣(ACP)負(fù)載重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(rhBMP2／ACP)納米緩釋體并觀察其細(xì)胞毒性，為進(jìn)一步體內(nèi)植入提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。［方法］采用濕化學(xué)法合成rhBMP2／ACP納米緩釋體；兔間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)與rhBMP2／ACP納米緩釋體進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)，觀察細(xì)胞在材料表面的黏附、增殖及功能表達(dá)，檢測材料的細(xì)胞毒性。［結(jié)果］材料浸提液對兔BMSCs的生長無影響，其細(xì)胞相對增殖率在1002％～1025％之間，細(xì)胞毒性評級為0級；BMSCs于復(fù)合材料表面的黏附、生長速度、形態(tài)與對照組無明顯差別。［結(jié)論］rhBMP2／ACP納米緩釋體無細(xì)胞毒性，復(fù)合培養(yǎng)不影響B(tài)MSCs的正常生理功能，細(xì)胞相容性良好。

【關(guān)鍵詞】重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2無定形硫酸鈣細(xì)胞培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞毒性

Abstract:［Objeetive］Todeveloptherecombinanthumanbonemorphogeneticprotein2(rhBMP2)loadedamorphouscalciumphosphate(ACP)delayedreleasenanosizedmaterial，investigateitscytotoxicityofcell，andprovideareferencefortheexperimentofcompositematerialinvivo．［Method］TherhBMP2／ACPdelayedreleasenanosizedmaterialwerepreparedbychemicalwetmethodandculturedonrabbitbonemarrowderivedmesenchymalstemcells(BMSCs)invitro．Thentheadhesion，proliferation，growthandfunctionalexpressionofBMSCsweremeasured．［Result］CytotoxicitytestdemonstratedthatrhBMP2／ACPdelayedreleasenanosizedmaterialhadnotaffectthepercentageofcell’sproliferationwithmaterialextractedliquidculturedwithBMSCsandthecytotoxicitywasgradedzero．Theadhesion，proliferation，configurationofthecellsonthesurfaceofthismaterialwereidenticaltothecontrolgroup．［Conclusion］ItwassuggestedthatrhBMP2／ACPdelayedreleasenanosizedmaterialmighthavegoodcellularbiocompatibility,nocytotoxicityandnoteffectedthenormalfunctionalexpressionofBMSCsinvitro．

Keywords:rhBMP2；amorphouscalciumphosphate；cellculture；BMSCs；cytotoxicity

目前，骨修復(fù)替代材料的研究在生物取材、細(xì)胞的體外培養(yǎng)、支架材料復(fù)合體等諸多方面積聚了豐厚的基礎(chǔ)。無定形磷酸鈣(amorphouscalciumplosphate，ACP)是在采用濕化學(xué)法合成羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)時(shí)發(fā)現(xiàn)一種磷酸鈣的無定形中間相，是一類X射線衍射為非晶態(tài)的磷酸鈣材料的總稱，具有典型的無定形物質(zhì)的球形面貌。研究發(fā)現(xiàn)ACP的骨傳導(dǎo)及細(xì)胞黏附性能優(yōu)于HA〔1〕，生物降解速率高于磷酸三鈣〔2〕，可降解可任意塑形，其化學(xué)組分、磷酸鈣顆粒的表面形態(tài)、表面親水性等，能滿足藥物分子和人體細(xì)胞對載體的多重要求〔3〕，但ACP不具備誘導(dǎo)成骨能力、降解速率不易控制等缺點(diǎn)。作者采用ACP包裹重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(recombinanthumanbonemorphogeneticprotein2，rhBMP2)，通過濕化學(xué)法合成技術(shù)，制備出rhBMP2／ACP納米緩釋體，以期發(fā)揮單一材料的原本優(yōu)勢，克服ACP的劣勢和rhBMP2易被體液稀釋及蛋白酶分解不能充分發(fā)揮成骨誘導(dǎo)活性等不足，進(jìn)一步提高材料的綜合性能。本研究在rhBMP2／ACP納米緩釋體研制等前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，觀察兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowderivedmesenchymalstemcells，BMSCs)在材料表面的黏附、增殖及功能表達(dá)，評價(jià)其細(xì)胞毒性。

1材料和方法

11rhBMP2／ACP納米緩釋體的制備

在ACP原研技術(shù)條件下〔4〕，取適量K2HPO4、CaCl2分別溶于乙醇形成A、B液，rhBMP2溶于A液，于B液中添加適量有機(jī)物靜置過夜后，將A液緩慢滴加到B液中，在反應(yīng)體系中加入01mol的NaOH以使pH保持在7左右，反應(yīng)2h，經(jīng)抽濾、洗滌，脫水干燥，獲得rhBMP2／ACP納米緩釋體。經(jīng)X線衍射檢測成品表征為無定形相；掃描電鏡觀察納米顆粒均勻圓整，具有較好的球形形貌(圖1)。納米緩釋體中rhBMP2釋放起始量1d為(1399±166)％，呈現(xiàn)快速釋放，隨后則維持有效濃度持續(xù)緩慢釋放，30d時(shí)累積釋放量為(4576±460)％(圖2)，符合雙向動(dòng)力學(xué)釋放規(guī)律。

12rhBMP2／ACP納米緩釋體的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

121實(shí)驗(yàn)材料

1211主要試劑：DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco)；胎牛血清(杭州四季青)；胰蛋白酶(美國Sigma)；MTT試劑(南京創(chuàng)瑞)；二甲基亞砜(DMSO，南京創(chuàng)瑞)；堿性磷酸酶試劑盒(ALP，南京建成)。

1212主要

儀器：倒置相差顯微鏡(德國Zeiss)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)；掃描電鏡(日本Hitachi)；超凈臺(tái)(蘇州凈化儀器廠)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國Herabus)；臺(tái)式高速普通離心機(jī)(德國Heraeus)；低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；酶標(biāo)儀(美國BIORAD)；微量移液器(法國Gilson)；電熱恒溫水浴箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)。

122材料浸提液制備

取rhBMP2／ACP納米緩釋體實(shí)驗(yàn)材料(以下簡稱實(shí)驗(yàn)材料)的固相粉末3g，經(jīng)60Co25kGy輻射滅菌后，浸入30ml浸體介質(zhì)(含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液)中，置37℃、5％CO2、100％濕度孵育箱內(nèi)靜置浸提，10d后取其上清液移入無菌玻璃容器內(nèi)密封備用。

123材料試件制備

將濕化學(xué)法合成制備的實(shí)驗(yàn)材料、對照材料(ACP由南京工業(yè)大學(xué)提供)預(yù)制成直徑2mm，厚度為3mm圓形標(biāo)準(zhǔn)試件，聚乙烯塑料袋雙層包裝，經(jīng)60Co25kGy輻射滅菌后備用。

124實(shí)驗(yàn)方法

1241BMSCs細(xì)胞的分離與培養(yǎng)取出生3d內(nèi)的乳兔(南京金陵種兔場提供)，頸椎脫臼法處死后置于75％酒精中浸泡20min消毒，無菌條件下取雙側(cè)肱骨以及股骨，剔去肌肉組織，用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液沖洗髓腔以及干骺端，以107個(gè)／ml的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2、飽和濕度的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，48h后棄去未貼壁的細(xì)胞，更換新鮮培養(yǎng)液，以后每3d更換一次培養(yǎng)液，細(xì)胞長到80％融合時(shí)，用025％的胰蛋白酶消化，按104個(gè)／cm2的細(xì)胞密度傳代培養(yǎng)，以第3代細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。

1242細(xì)胞增殖率檢測(MTT法)將常規(guī)收集的第3代BMSCs，用025％胰酶消化計(jì)數(shù)后分為2組：實(shí)驗(yàn)材料組加100％浸提液，對照組加DMEM培養(yǎng)液，每組復(fù)種8孔，置37℃、5％CO2、100％濕度孵育箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長形態(tài)；于接種后2d、4d、6d和8d，分別進(jìn)行MTT檢測：每孔加入MTT溶液20μl，培養(yǎng)4h后用移液器吸除孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，再于每孔內(nèi)加入DMSO150μl，振蕩5min，待完全溶解后，置酶標(biāo)儀500nm波長處測定各孔吸光光度值，各組所測結(jié)果取平均值，計(jì)算細(xì)胞相對增殖率(relativegrowthrate，RGR)。RGR=實(shí)驗(yàn)組吸光度值／對照組吸光度值×100％。

1243細(xì)胞黏附率檢測將實(shí)驗(yàn)材料試件置入培養(yǎng)板孔內(nèi)，調(diào)整密度為5×105／ml的細(xì)胞懸液滴加到材料上，置孵育箱內(nèi)培育4h，PBS緩沖液沖洗，去除未黏附的細(xì)胞，以025％的胰酶消化計(jì)數(shù)后計(jì)算細(xì)胞黏附率。黏附率=黏附細(xì)胞數(shù)／總細(xì)胞數(shù)×100％。設(shè)相同面積ACP材料作為對照。

1244細(xì)胞形態(tài)觀察將實(shí)驗(yàn)材料試件安放于24孔培養(yǎng)板孔底，與1×105／ml密度的BMSCs直接接種于材料上，常規(guī)培養(yǎng)8d后取出試件，以3％戊二醛固定，PBS緩沖液漂洗3次，30%～100％梯度乙醇脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點(diǎn)干燥，表面噴金，掃描電鏡觀察。

1245ALP含量檢測取第3代BMSCs與實(shí)驗(yàn)材料(ACP材料為對照)復(fù)合培養(yǎng)，分別于2d、4d和8d終止，棄去培養(yǎng)液，PBS緩沖液漂洗3次，每孔加入Tritonxl00細(xì)胞裂解液100μl，4℃24h充分裂解細(xì)胞，酶標(biāo)儀450nm處測定各孔吸光度值，計(jì)算ALP含量。

125統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS100統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，單因素方差分析，P＞005為無顯著性差異。

2結(jié)果

21細(xì)胞相對增殖率(MTT法)

RGR實(shí)驗(yàn)材料組為1002％～1025％，空白對照組為100％，兩組間無顯著性差異(P＞005)；兩組細(xì)胞毒性評級均為0級。表明實(shí)驗(yàn)材料對兔BMSCs無細(xì)胞毒性(見表1)。

22細(xì)胞黏附率測定

BMSCs在實(shí)驗(yàn)材料表面的黏附率為(838±86)％，對照組為(789±72)％，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞005)。

23細(xì)胞生長形態(tài)觀察

倒置相差顯微鏡下觀察：貼壁細(xì)胞胞膜完整，胞漿飽滿，胞核明顯，具有正常的細(xì)胞形態(tài)(圖3)。2d時(shí)實(shí)驗(yàn)材料邊緣可見細(xì)胞附著生長，細(xì)胞多呈梭形，似成纖維細(xì)胞(圖4)。4d時(shí)細(xì)胞在材料完全鋪展，細(xì)胞形態(tài)為梭形、多角形，胞體伸出細(xì)長突起，生長趨勢良好。第8d細(xì)胞已鋪滿瓶底，呈多層集結(jié)，排列無規(guī)律。動(dòng)態(tài)觀察中，未見細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。傳代細(xì)胞形態(tài)與原代相似。掃描電鏡可見實(shí)驗(yàn)材料表面及孔隙中有大量細(xì)胞黏附、增殖、生長，細(xì)胞呈梭形或多角形，并從胞體伸出數(shù)量不等、長短不

一、形態(tài)各異的突起，相互網(wǎng)絡(luò)，生長活躍(圖5、6)。表1MTT檢測結(jié)果及細(xì)胞毒性分級

測定時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組OD值(±s)RGR(%)毒性分級對照組OD值(±s)RGR(%)毒性分級2d0323±0023102500315±0023100004d0686±0025100400683±0020100006d0935±0022100200933±0021100008d1227±0025100201225±001910000圖1掃描電鏡下材料的形態(tài)圖圖2rhBMP2累積釋放曲線圖3倒置相差顯微鏡下觀察第3代BMSCs細(xì)胞形態(tài)圖4實(shí)驗(yàn)材料與BMSCs共培養(yǎng)第2d細(xì)胞形態(tài)圖5、6掃描電鏡下實(shí)驗(yàn)材料與BMSCs共培養(yǎng)第8d細(xì)胞形態(tài)(×400，×1500)24ALP含量測定

各時(shí)間點(diǎn)ALP含量見表2，2d時(shí)兩組ALP無明顯差別(P＞005)，隨培養(yǎng)時(shí)間的增加，實(shí)驗(yàn)材料組明顯高于ACP材料組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<005)。表2兩組材料各時(shí)間點(diǎn)ALP含

3討論

理想的載體材料應(yīng)具備與種子細(xì)胞的良好相容性、形狀的可塑性、易降解性和低抗原性等優(yōu)點(diǎn)〔5〕。羥基磷灰石、磷酸三鈣和生物活性玻璃等無機(jī)高分子材料具備良好的材料組織界面，但材料脆性大，不易降解或降解速率難以控制，故應(yīng)用受到限制。ACP是一種不同于羥基磷灰石和磷酸氫鈣的混合物，進(jìn)程結(jié)構(gòu)近似于磷灰石的Ca6(PO4)6團(tuán)族和β相磷酸三鈣的Ca3(PO4)2團(tuán)族〔6〕。以濕化學(xué)法合成制得的rhBMP2／ACP納米緩釋體，期望能優(yōu)勢互補(bǔ)，充分利用ACP在生物礦化過程中顯現(xiàn)出的無定形物質(zhì)各向同性的特點(diǎn)以賦予骨骼較高的力學(xué)性能，以及可降解、可任意塑形、通過改變組分進(jìn)行調(diào)節(jié)〔1〕等特性和rbBMP2良好的誘導(dǎo)成骨作用〔7〕，尋求一種具有良好的生物活性、細(xì)胞黏附性、細(xì)胞相容性及可控的生物降解速率與新骨生成速率相匹配的骨修復(fù)替代材料。本實(shí)驗(yàn)制備品經(jīng)檢測納米緩釋體的物性、粒徑、表面形貌等保持了原材料的基本屬性。其負(fù)載的rhBMP2具有較好的體外釋放起始濃度，且能維持相應(yīng)濃度持續(xù)緩釋，釋放規(guī)律與BMSCs向成骨細(xì)胞分化的時(shí)間相符，表明ACP球形納米微觀結(jié)構(gòu)的高吸附性，能負(fù)載更多的活性因子，而表面微結(jié)構(gòu)較低的粗糙度則能為細(xì)胞的黏附提供更多的附著點(diǎn)，為細(xì)胞行使功能建立適宜的框架基礎(chǔ)和代謝場所。ACP負(fù)載rhBMP2后，有效控制了外源性生長因子在局部持續(xù)有效濃度的釋放，并保持著良好的生物活性，發(fā)揮了rhBMP2誘導(dǎo)成骨的良好效能。復(fù)合培養(yǎng)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞黏附率、RGR及ALP測定指標(biāo)與ACP材料相比均有不同程度提高，表明實(shí)驗(yàn)材料較ACP材料更有利于細(xì)胞的黏附，并為細(xì)胞在其表面的生長、增殖及分泌基質(zhì)提供了良好的微環(huán)境。

對生物材料進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)是檢測材料細(xì)胞相容性的基本內(nèi)容，常以體內(nèi)或體外方法檢測。體內(nèi)植入法因受體內(nèi)多種因素影響難以單獨(dú)反映生物材料與細(xì)胞的相容性，故本實(shí)驗(yàn)選擇細(xì)胞體外復(fù)合培養(yǎng)法，通過直接觀測材料浸提液或材料表面種植細(xì)胞的形態(tài)變化與數(shù)量增減及功能表達(dá)等，可準(zhǔn)確判定受試材料對細(xì)胞的毒性大小。作為對受試材料細(xì)胞毒性的初步評價(jià)，該方法具有簡便快捷、敏感直觀、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)〔8〕。目前最為常用的MTT法，利用活細(xì)胞中的線粒體琥珀酸脫氫酶將MTT還原成難溶的藍(lán)紫色甲瓚晶粒，而DMSO可溶解該結(jié)晶物顯色，通過檢測其吸光度值間接反映活細(xì)胞的生長、增殖等情況。本實(shí)驗(yàn)采用兔骨髓取材便利，經(jīng)分離液離心分層后，單核及有核細(xì)胞較易析出，分離培養(yǎng)簡單易行，BMSCs體外培養(yǎng)擴(kuò)增后與實(shí)驗(yàn)材料浸提液混合培養(yǎng)，MTT檢測能快速對材料的細(xì)胞毒性做出可靠的定量評定。細(xì)胞毒性通常隨溶出物濃度的增高而增大，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用浸提10d獲得的高濃度浸提液以便細(xì)胞毒性的顯現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)材料對BMSCs增殖沒有影響，RGR＞100％，細(xì)胞毒性評級為0級，表明受試材料無細(xì)胞毒性；活細(xì)胞數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長逐漸增多，各時(shí)間點(diǎn)活細(xì)胞數(shù)實(shí)驗(yàn)組高于對照組，說明受試材料對BMSCs的增殖有促進(jìn)作用：直接接種于實(shí)驗(yàn)材料表面的BMSCs黏附、增殖良好，生長形態(tài)、速度與對照組無明顯差別，進(jìn)一步證明受試材料具有良好的細(xì)胞親和性。細(xì)胞與材料的黏附是細(xì)胞增殖和分化的基礎(chǔ)，ALP被認(rèn)為是細(xì)胞外基質(zhì)成熟的早期標(biāo)志，在BMSCs體外成骨中促使基質(zhì)礦化，可間接反映細(xì)胞的成骨活性。ALP活力是細(xì)胞早期分化的重要指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)ALP活性實(shí)驗(yàn)組明顯優(yōu)于對照組，表明實(shí)驗(yàn)材料對BMSCs向成骨細(xì)胞的定向分化有良好的誘導(dǎo)作用，可能和骨誘導(dǎo)生長因子與適宜載體緩釋系統(tǒng)結(jié)合形成的微環(huán)境有關(guān)。

本研究通過實(shí)驗(yàn)材料與活細(xì)胞體外接觸實(shí)驗(yàn)證實(shí)，材料與BMSCs可良好黏附并使其增殖。不具有細(xì)胞毒性，ACP復(fù)合rhBMP2增高了細(xì)胞黏附率。增強(qiáng)了細(xì)胞ALP活性，緩釋系統(tǒng)的構(gòu)建環(huán)境有利于種子細(xì)胞的生長和功能表達(dá)，表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性，為進(jìn)一步行rhBMP-2／ACP納米緩釋體體內(nèi)植入提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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