克霉唑藥生物限度實驗范文

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1實驗材料及儀器

1.1儀器與樣品

HTY-2000型智能集菌儀、多次使用集菌器、一次性薄膜過濾器（杭州泰林生物技術設備有限公司）、離心機（800型沉淀離心機，上海手術器械十廠）、高壓蒸汽滅菌器、電子天平、生物安全柜、生化培養箱等。克霉唑藥膜（規格：4mg，貴州德軒堂制藥有限公司生產批號：051225、051226、051227）。

1.2培養基、稀釋劑及試劑

營養瓊脂、營養肉湯、玫瑰紅鈉瓊脂、改良馬丁培養基、膽鹽乳糖增菌培養基、溴化十六烷基三甲胺瓊脂、亞碲酸鹽肉湯、甘露醇氯化鈉瓊脂、0.9%氯化鈉溶液、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（中國北京三科科技開發公司生產，按CP2005版規定配制及滅菌）［1］。

1.3試驗用菌種

大腸埃希菌Escherichiacoli、金黃色葡萄球菌Staphylocoddusaureus、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、白色念珠菌Candidaaibicans、黑曲霉Aspergillusniger、銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa[CMCC（B）10104]，菌種均來源于中國醫學細菌保存中心，均為不超過5代的菌株［1］。

2方法

參照CP2005年版二部附錄微生物限度檢查法中計數方法的驗證、控制菌檢查方法的驗證。

2.1菌液制備方法

取經（36±1）℃培養16~18h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌肉湯新鮮培養液，加入0.9%氯化鈉溶液或營養肉湯，10倍遞增稀釋制成50~100cfu/ml菌液，計數備用。取經26℃培養24~48h的白色念珠菌的改良馬丁液體新鮮培養液，用0.9%氯化鈉溶液10倍稀釋制成50~100cfu/ml菌液計數，備用。取經26℃培養5~7d的黑曲霉改良馬丁斜面培養物，加適量0.9%氯化鈉溶液洗下孢子，取孢子懸液加入0.9%氯化鈉溶液10倍稀釋制成50~100cfu/ml孢子懸液計數，備用。

2.2供試液制備方法

取樣品100cm2，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，振搖，使充分分散均勻，即為1∶10供試液；取上述1∶10供試液10ml加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液分別至50、100、200ml，即為1∶50、1∶100、1∶200供試液。

2.3敏感菌的確定及細菌、霉菌、酵母菌計數方法選擇試驗及驗證試驗方法

為確定克霉唑藥膜的敏感菌，選擇有效的去除抑菌活性的方法，用CP2005年版平皿稀釋法、低速離心沉淀處理供試液與平皿稀釋法聯用、低速離心沉淀處理供試液與薄膜過濾法聯用消除其抑菌活性［1，2］；對試驗菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉進行活菌計數回收試驗，從各菌的回收結果確定敏感菌，選擇出回收率在70%以上的方法作為有效方法，各試驗菌作3個批號驗證試驗以對方法進行評價。

2.3.1平皿稀釋法［1］每皿中分別加入1∶10供試液1ml、0.2ml，每皿分別各加入試驗菌50~100cfu，立即傾注規定的瓊脂培養基15~20ml，每種試驗菌平行制備2個皿，置規定溫度，培養、計數菌落數作為試驗組；不加入供試液，同法測定相應加入的試驗菌數，作為菌液組；不加入試驗菌，同法測定1∶10供試液1ml、0.2ml中的本底菌數作為空白組，計算回收率。回收率（%）=[(試驗組平均菌落數-空白組平均菌落數)÷菌液組平均菌落數]×100%。

2.3.2離心加薄膜過濾法聯用取供試液10ml于500r/min離心4~5min，管底離心沉淀物0.25ml，取出全部上層液混勻，即為供試液，加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（沖洗液室溫或加熱至40~45℃）約90ml中，混勻過濾沖洗，在最后一次沖洗夜中加入試驗菌。取膜貼于規定的瓊脂培養基，作為試驗組，培養、計數菌落數［1］；在沖洗液中加入與試驗組等量試驗菌液，過濾，取膜貼于規定的瓊脂培養基作為菌液組；不加入試驗菌，同法測定供試液中的本底菌數，作為空白對照；計算回收率（同平皿稀釋法）。

2.3.3沖洗方法條件選擇采用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每個濾器60、80~90ml/次，沖洗量300ml、500ml或800ml，在最后一次沖洗液中加試驗菌液，沖洗液溫度為室溫、40~45℃，按沖洗效果進行選擇。

2.4控制菌檢查驗證試驗

2.4.1銅綠假單胞菌取1∶10供試液10ml，按CP2005年版二部附錄微生物限度檢查法中銅綠假單胞菌規定的相應方法進行驗證。

2.4.2金黃色葡萄球菌取1∶10供試液10ml500r/min，離心5min，取全部上清液加至裝有約80mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的濾器中按薄膜過濾法過濾，沖洗3次，100ml/次，取膜加至相應的增菌培養基100ml中，以下操作按CP2005年版二部附錄微生物限度檢查法中金黃色葡萄球菌檢查的相應方法進行驗證。

3結果

3.1敏感菌確定及細菌、霉菌及酵母菌計數方法選擇試驗

大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌用平皿稀釋法1∶10供試液，每皿1ml，前3種細菌的回收率分別為97%、65%、89%，枯草芽孢桿菌、白色念珠菌無回收，大腸埃希菌、黑曲霉回收率均達到70%以上；每皿0.2ml金黃色葡萄球菌回收率為118%；枯草芽孢桿菌、白色念珠菌也無回收，因此確定為敏感菌。用低速離心沉淀處理供試液與薄膜過濾法聯用消除克霉唑抑菌活性，枯草芽孢桿菌500r/min離心5min，薄膜過濾，沖洗300ml，取供試液10ml（濃度1∶10、1∶100、1∶200），回收率分別為0、52%、95%，1∶200可達70%以上；白色念珠菌500r/min離心4min，薄膜過濾。結果見表1。表1敏感菌確定及消除抑菌活性方法選擇試驗結果（回收率%）

3.2驗證試驗結果

3.2.1大腸埃希菌、黑曲霉、金黃色葡萄球菌驗證結果前2種試驗菌采用平皿法，每皿加入1∶10供試液1ml；金黃色葡萄球菌用平皿稀釋法，每皿加入1∶10供試液0.2ml，作3個批號樣品回收試驗，結果見表2。

3.2.2枯草芽孢桿菌、白色念珠菌驗證結果

根據方法選擇結果，枯草芽孢桿菌驗證方法采用離心沉淀處理供試液與薄膜過濾法聯用，取1∶200供試液10ml，500r/min離心5min，取全部上清液表2大腸埃希菌、黑曲霉、金黃色葡萄球菌驗證試驗結果(cfu)注：空白組均為ocfu

加入約90ml沖洗液中，過濾，60ml/次沖洗5次，共300ml，作3個批號樣品，結果見表3。

白色念珠菌驗證：根據選擇結果，離心沉淀處理供試液，用薄膜過濾，沖洗液溫度提高至40~45℃，沖洗，上清液0.25ml、0.2ml沖洗500ml，回收均能達70%以上。取1∶10供試液10ml，500r/min,離心4min，全部上清液混勻，取0.25ml過濾，40~45℃沖洗液每次80~90ml沖洗6次，共500ml，3個批號樣品分別作回收試驗，平行作2個膜，結果見表3。表3枯草芽孢桿菌、白色念珠菌離心加薄膜濾法驗證試驗結果注：空白組均為ocfu

3.2.3稀釋劑對照組由于2種敏感菌計數方法采用離心、薄膜過濾、沖洗，為考察供試液中微生物受影響的程度，作稀釋劑對照組回收試驗。pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液加入試驗菌，濃度為50~100cfu/10ml；取10ml與試驗組同法離心加薄膜過濾、沖洗，取膜貼于規定的瓊脂培養基，測定菌數，為試驗組；不作離心加薄膜過濾、沖洗為菌液組，計算回收率，結果均能達到70%以上。

3.2.4控制菌檢查驗證試驗結果見表4。表4銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌驗證試驗結果注：BL增菌液為100ml；+：生長相應典型菌落或陽性反應；—：無菌生長或陰性反應

4討論

4.1克霉唑為抗真菌藥，按CP2005年版規定的驗證菌株為試驗菌分別作回收，從本組結果看出，平皿稀釋法白色念珠菌、枯草芽孢桿菌均無回收，離心加薄膜過濾法1∶10供試液無回收、1∶50為8%，藥物對真菌白色念珠菌有很強抗菌活性，對細菌枯草芽孢桿菌也顯示較強抗菌作用，即克霉唑藥膜抗真菌的敏感菌為白色念珠菌敏感菌、細菌為枯草芽孢桿菌。藥物對大腸埃希菌、黑曲霉（采用平皿法）均未顯示有抑菌活性，試驗中金黃色葡萄球菌采用平皿稀釋法回收率均大于70%，顯示有一定抑菌活性。

4.2為消除藥物對敏感菌的抑菌活性，采用離心加與薄膜過濾法對2種敏感菌進行了方法條件的選擇。

白色念珠菌1∶10、1∶50供試液10ml經500r/min離心4min，膜法沖洗300ml，回收率為0%、8%；取上清液1ml室溫沖洗300ml、500ml、800ml，均無回收。

沖洗液溫度對白色念珠菌回收的影響：由于克霉唑難溶于水，膜法過濾沖洗液溫度較低時，藥物及輔料溶解不充分截留于膜上藥物不能沖洗干凈，1∶10供試液上清液0.25ml試驗結果無回收；將沖洗液溫度加熱提高至40~45℃沖洗，取上清液0.25ml、0.2ml沖洗500ml回收率均能達70%以上；結合表3對3個批號樣品的驗證試驗結果，該法能有效消除藥物對白色念珠菌抗菌活性，回收率均能達70%以上，重現性好。

枯草芽孢桿菌1∶10、1∶100、1∶2003種供試液試驗結果：前2種回收均達不到70%；1∶200供試液可消除其抑菌活性，回收率達70%以上；結合表3對3個批號樣品的驗證試驗結果，該法能有效消除藥物對枯草芽孢桿菌抗菌活性，回收率均能達70%以上。

4.3稀釋劑對照組結果：與試驗組同法，白色念珠菌、枯草芽孢桿菌在離心加薄膜過濾及沖洗條件下基本不受影響，回收率均能達到70%以上。

4.4控制菌金黃色葡萄球菌檢查方法驗證：3個批號驗證試驗結果均能檢出金黃色葡萄球菌，陰性菌對照組結果顯示方法專屬性好（表4）；表4結果顯示銅綠假單胞菌檢查方法可按CP2005年版二部附錄微生物限度檢查法規定的方法檢查。

4.5根據試驗研究的結果，建立克霉唑藥膜微生物限度檢查方法細菌計數：取1∶200的供試液10ml于500r/min離心5min，取全部上清液加至裝有約90mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中混勻，過濾，60ml/次，沖洗5次，共300ml；其它操作按CP2005年版二部微生物限度檢查法薄膜過濾法。霉菌、酵母菌計數：取1∶10的供試液10ml于500r/min離心4min，取出全部上清液混勻作為供試液，取0.25ml加至裝有約100ml45℃pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中混勻，過濾，用45℃沖洗液沖洗6次，80~90ml/次，共500ml，作4個膜（取樣量共1ml）；其它操作按CP2005年版二部附錄微生物限度檢查法薄膜過濾法。

計數結果計算：X=A×K。X：菌數（cfu/10cm2）；A細：營養瓊脂平板膜上的菌落數或菌落平均數；A霉菌、酵母菌：4個玫瑰紅鈉瓊脂平板膜上的菌落總數；K：稀釋倍數，K細=20，K霉、酵=10。

控制菌檢查：銅綠假單胞菌，取1∶10供試液10ml，按CP2005年版二部微生物限度檢查法相應方法檢查；金黃色葡萄球菌，取1∶10供試液10ml，500r/min離心5min,取全部上清液，加至裝有約90mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的濾器中，過濾，沖洗3次，100ml/次，取膜加至相應的增菌培養基100ml中，以下操作按CP2005年版二部微生物限度檢查法中相應方法檢查。

以上建立的方法能有效的控制該藥品質量，可作為克霉唑藥膜的微生物限度檢查方法。