絲素在生物醫(yī)學(xué)中的作用范文

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1絲素蛋白基本性質(zhì)的研究

蠶絲是由20%~30%的絲膠蛋白和70%~80%的絲素蛋白以及極少量的色素、碳水化合物等構(gòu)成。其中,絲膠蛋白是一種高分子量的球蛋白,其分子結(jié)構(gòu)的支鏈上親水基含量較高,鏈排列不緊密,故易溶于水、稀酸和稀堿,并能被蛋白酶等水解,還具有與明膠類似的凝膠、粘著等特性。絲素蛋白由分子量為5萬(wàn)左右的小肽鏈和分子量為30萬(wàn)左右的大肽鏈組成。其蛋白質(zhì)的氨基酸組成以甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸為主,與人體的皮膚和頭發(fā)的角朊極為接近,這成為一些研究中,將絲素用于人造皮膚制造的原因之一。絲素蛋白的結(jié)晶部分為較為緊密的β-折疊結(jié)構(gòu),在水中僅發(fā)生膨脹而不能溶解,亦不溶于乙醇等有機(jī)溶劑,但可在一些特殊的中性鹽溶液中發(fā)生無(wú)限膨脹形成粘稠的液體,透析除鹽即可得到絲素的純?nèi)芤骸Ｈ缓笸ㄟ^(guò)噴絲、噴霧或延展、干燥等處理,可得到再生絲、凝膠、薄膜或微孔材料等產(chǎn)品。

對(duì)絲素蛋白的研究發(fā)現(xiàn),與明膠、清蛋白等普通蛋白相比,其固化結(jié)晶方式具有多樣化的特點(diǎn):既可沿用一般天然蛋白的傳統(tǒng)固化工藝,采用戊二醛做交聯(lián)劑;也可以通過(guò)一些獨(dú)特的處理方式來(lái)達(dá)到目的,如冷凍、熱蒸、拉伸及低毒性有機(jī)溶劑浸泡等[1]。特別是采用冷凍干燥,短時(shí)高溫與乙醇浸泡的協(xié)同處理方式,可以很好地保持天然蛋白的高度生物親和性,并適應(yīng)藥物載體應(yīng)用中,一些對(duì)高溫或某種固化劑敏感的負(fù)載藥物的特殊要求,在應(yīng)用方面體現(xiàn)出更大的靈活性。在絲素蛋白的特性研究中,其良好的成膜性是最受人們關(guān)注的熱點(diǎn)之一[1]。與傳統(tǒng)應(yīng)用較多的天然高分子材料———?dú)ぞ厶桥c膠原等相比,絲素蛋白膜成膜方便性更好,還可以保持高達(dá)98%以上的透明性,在高濕狀態(tài)下的柔韌性與形態(tài)保持性能也較為突出[1],有利于制造一些在臨床或?qū)嶒?yàn)中要求透明性,以便觀測(cè)提取生物信息或體內(nèi)高濕環(huán)境使用的生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品。另外,在成膜條件適當(dāng)?shù)那闆r下,絲素膜可以表現(xiàn)出優(yōu)良的透氧透氣性能,如1mm厚的絲素膜,其透氧率每平方米可高達(dá)33mL/h[1],不亞于甚至超過(guò)目前一般認(rèn)為在這方面性能卓越的合成材料,如聚-L-亮氨酸膜或聚羥乙基丙烯酸膜。但單純的絲素蛋白膜也存在一些缺陷。

因?yàn)榧兘z素膜的穩(wěn)定性和強(qiáng)度主要取決于膜中的β結(jié)構(gòu)和分子間氫鍵,但純絲素膜中這兩者含量并不多,使絲膜的結(jié)晶區(qū)相對(duì)較少,使其在某些應(yīng)用中受到限制。例如純絲素膜在含水量極低時(shí)易于破碎,在低濕環(huán)境應(yīng)用時(shí)強(qiáng)度不夠;結(jié)晶區(qū)偏少也會(huì)導(dǎo)致絲素膜在溶液中的溶失率較高。對(duì)此,目前除了篩選合適的固化工藝來(lái)提高膜的結(jié)晶區(qū)比例外,研究中的一個(gè)新熱點(diǎn)是希望通過(guò)復(fù)合材料性能互補(bǔ)的原理,來(lái)多方位的改善絲素膜的物理性能。目前用來(lái)與絲素構(gòu)建復(fù)合材料的主要有:海藻酸鈉、殼聚糖、聚谷氨酸鈉、間規(guī)聚乙烯醇等[1-4]。其中,海藻酸鈉分子量為5萬(wàn)~20萬(wàn),按適當(dāng)比例與絲素復(fù)合后,在紅外光譜中可見(jiàn)膜中的β結(jié)構(gòu)吸收峰增高,有效地增加了絲素膜的總結(jié)晶度。而且海藻酸鈉具有優(yōu)良的吸水性,與絲素復(fù)合后,使復(fù)合膜在斷裂強(qiáng)度、熱穩(wěn)定性與吸濕性方面均比純絲素膜得到了比較顯著的改善[2]。

2生物分析及藥物緩釋載體方面的應(yīng)用

在固定化酶及免疫測(cè)定方面的應(yīng)用研究已較為深入,取得了不少有應(yīng)用價(jià)值的成果。如日本利用絲素固化特定的單克隆抗體,開(kāi)發(fā)成功癌癥自動(dòng)診斷儀,其敏感度達(dá)到7min內(nèi)能測(cè)定1μg/L腫瘤標(biāo)識(shí)體AFP濃度,受到廣泛注目[1,5]。基于絲素能將酶固定,又具有良好的基質(zhì)透過(guò)性,能使酶保持足夠的自由度的原理,將治療苯丙酮尿癥的藥物苯丙氨酸酶負(fù)載在絲素上,可以在酶解效應(yīng)與游離態(tài)酶相當(dāng)?shù)那闆r下,防止該酶與腸內(nèi)的胰蛋白酶等作用失活,從而延長(zhǎng)其在體內(nèi)的半衰期3~4倍,起到比直接口服更好的治療效果。同樣根據(jù)此原理,日本研制出葡萄糖氧化酶絲素固定膜,作為測(cè)定葡萄糖濃度的生物傳感器的響應(yīng)部件,獲得了非常令人滿意的測(cè)定結(jié)果,測(cè)定穩(wěn)定性亦較好[6,7]。

特殊的多孔性網(wǎng)狀膜結(jié)構(gòu)使絲素膜本身具有優(yōu)良的吸附及緩釋功能,若經(jīng)過(guò)丙烯酰接枝反應(yīng)后其最大吸水率可達(dá)300倍左右[8],能大大提高凝膠態(tài)的水及乳化油的穩(wěn)定性,從而抑制揮發(fā)性成分的蒸發(fā),延緩經(jīng)過(guò)皮膚吸收的藥物釋放速度,成為很好的藥物緩釋劑。另外,目前一些比較昂貴或全身性副作用比較大的藥物如抗癌藥物直接口服則效果低、成本高,因此將藥物負(fù)載在一些天然蛋白質(zhì)如明膠、血清蛋白中,并添加磁粉制成磁微粒,然后通過(guò)磁控制從血液輸送到靶位,可以顯著地提高靶位藥物濃度,降低全身副作用,是一種極有應(yīng)用價(jià)值的藥物治療方式。但明膠、血清蛋白往往有較明顯的抗原或在固定化時(shí)需要高溫,而這類藥物中有許多在高溫下都易降解,容易影響負(fù)載率。絲素抗原性不明顯[6],還可以選擇一些非高溫方式固化。因此,很有可能成為制造這種靶向藥物載體的一種新材料。總的來(lái)講,目前利用絲素負(fù)載藥物或酶時(shí),一般采用2種方式:簡(jiǎn)單包埋法與共價(jià)交聯(lián)法。

前者主要是被負(fù)載物與絲素溶液簡(jiǎn)單混合后固化成產(chǎn)品,具有簡(jiǎn)單方便,一般不采用過(guò)多化學(xué)試劑的特點(diǎn),可以較好地保存絲素的天然性。但由于負(fù)載方式是吸附式,所以負(fù)載的牢固程度欠佳;而且對(duì)酶來(lái)講,由于被包在絲素蛋白內(nèi)部,使大分子底物不容易透過(guò),從而限制了使用性能。而共價(jià)交聯(lián)法是根據(jù)絲素蛋白分子中含有大量側(cè)鏈羥基和一定量的氨基的特點(diǎn),采用包括戊二醛在內(nèi)的多種化學(xué)試劑處理使被負(fù)載物與絲素間產(chǎn)生共價(jià)鍵,使之較為穩(wěn)定地固定在絲素蛋白上。這種方式加工工藝比較復(fù)雜,對(duì)不同的被負(fù)載物來(lái)講往往不具備廣泛適用性。一些固定劑有可能影響絲素的生物親和性。但由于負(fù)載穩(wěn)定,不容易引起所謂的暴釋現(xiàn)象,而且可以將酶固定在膜的表面。因此,在體外使用的生物分析中,顯然比簡(jiǎn)單包埋法要好。但在體使用時(shí),應(yīng)該注意到一些高毒化學(xué)試劑對(duì)絲素親和性的破壞,在緩釋時(shí)間能夠保證的情況下,簡(jiǎn)單包埋法仍然不失為一種快捷簡(jiǎn)便的方法。

3人工器官及組織工程支撐體材料方面的應(yīng)用

目前應(yīng)用絲素制造人工器官的熱點(diǎn)主要集中在人造皮膚上,已有暫時(shí)性皮膚替代物應(yīng)用于燒傷的臨床治療上[6,7,9],被認(rèn)為比目前常用的豬皮或創(chuàng)可貼擁有更良好的應(yīng)用性能:其透明性使觀察創(chuàng)面的情況較為容易;創(chuàng)面的痛感較弱,絲膜與創(chuàng)口貼合緊密,但又不易融化,可以防止感染,同時(shí)又保持良好的透氣性,再加上絲素本身對(duì)皮膚細(xì)胞的生長(zhǎng)促進(jìn)功能,使其愈創(chuàng)效果更顯突出。而且絲素膜在消毒、剪裁與保存方面也比豬皮方便[6]。在人工血管和角膜方面探索相對(duì)而言比較少,亦大多停留在短期替代物的研制或應(yīng)用基礎(chǔ)研究上,離具有完整功能的組織構(gòu)建還有相當(dāng)距離。但從已有的一些研究(如隱型眼鏡的制造使用)至少顯示,絲素材料在這些器官中應(yīng)用時(shí)生物親和性能良好,已經(jīng)具備了進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的潛力。另外,組織工程的一項(xiàng)重要內(nèi)容是研究用于組織修復(fù)的生物替代物。其中,具有良好生物相容性、生物可降解吸收的支撐體材料的開(kāi)發(fā)尤其受到國(guó)內(nèi)外的廣泛重視[1,7,9]。

目前,具備上述功能的較有代表性的合成高分子材料有聚乳酸、聚酸酐和聚羥基乙酸等,天然高分子材料有殼聚糖、膠原纖維等。由于絲素蛋白與人體皮膜組織的氨基酸構(gòu)成相近,生物相容性好,而且來(lái)源豐富,易于得到高純度的材料,成型加工方便,特別是可利用蠶絲生產(chǎn)中的大量副產(chǎn)物———下腳繭與廢絲作為原料,故成本較低。而且,根據(jù)國(guó)內(nèi)外的研究[7,9]及我們目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,絲素蛋白的降解產(chǎn)物本身不僅對(duì)組織無(wú)毒副作用,還對(duì)如皮膚、牙周組織有營(yíng)養(yǎng)與修復(fù)的能力,對(duì)肝臟功能的恢復(fù)亦頗有特色。另外,經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理的絲素膜能承受在常規(guī)高溫滅菌消毒和細(xì)胞培養(yǎng)液的浸泡而形狀不會(huì)產(chǎn)生明顯變化,在吸水的情況下,α型絲素膜的多孔網(wǎng)狀凝膠結(jié)構(gòu)能夠適應(yīng)細(xì)胞的附著、鋪展,對(duì)增殖極為有利。因此,絲素有望成為有發(fā)展?jié)摿Φ男滦徒M織工程三維支撐體材料,用于制造真正意義上的永久性人工器官。

4急待解決的一些問(wèn)題

4.1特殊器官中的生物親和性的研究

根據(jù)大量的研究顯示,絲素膜在皮膚、口腔及眼睛等部位的生物相容性良好,抗原性不明顯,皮下埋植試驗(yàn)表明,無(wú)明顯炎癥或占位現(xiàn)象發(fā)生[6,7,9,10]。但要將絲素膜應(yīng)用于與血液直接接觸的器官如人工血管的建造上,其血液相容性則必須加以詳細(xì)的研究。尤其是,血液相容性與膜的結(jié)晶結(jié)構(gòu)及表面狀態(tài)密切相關(guān),故絲素膜成膜條件或復(fù)合膜的復(fù)合物選擇,應(yīng)不僅取決于對(duì)膜力學(xué)性能的考慮,還應(yīng)綜合考慮其在特殊器官中的生物相容性。絲素的氨基酸排列是以—(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser-)—重疊結(jié)構(gòu)為特征的,其中,Ser之間的距離,與肝磷脂中的抗血凝結(jié)構(gòu)即硫酸基間的距離十分相近,因此在絲素中的Ser上引入硫酸基進(jìn)行改性處理,就有可能增加其血液相容性。而且根據(jù)初步的研究,改性后的絲素在抗凝血性能方面得到了明顯的改善,雖然仍然比肝磷脂略低,但確實(shí)顯示出積極的結(jié)果[8]。對(duì)其抗凝血機(jī)理進(jìn)一步的探索,有可能使絲素成為比較好的人工血管構(gòu)建材料。

4.2在體藥物負(fù)載及降解特性的研究

在生物醫(yī)學(xué)高分子的研究中,最受關(guān)注的是生物可降解的高分子。在通常情況下,原始狀態(tài)下的絲素蛋白,除其中占總體極少部分的非結(jié)晶區(qū)對(duì)稀酸稀堿有一定程度的敏感性,可部分降解外,整體的酶降解性能極差,使得其生物降解性不好[11]。而經(jīng)過(guò)我們研究表明,通過(guò)中性鹽溶解法使絲素蛋白分子量適當(dāng)降低,暴露出部分可酶切部位,可以使絲素蛋白的體外酶解率大大提高,表現(xiàn)為可被胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等降解成為分子量幾十到幾百的小分子肽。而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,其消化吸收率可由原來(lái)的20%上升到50%以上。絲素蛋白在成膜以后的生物降解性能則不但取決于絲素的分子量,還與成膜條件有關(guān)。目前在用絲素蛋白負(fù)載藥物或酶時(shí)主要是利用普通包埋法,即絲素溶液與被負(fù)載的物質(zhì)混合,然后干燥固化成膜的方式。為了提高被負(fù)載物穩(wěn)定性,往往在后期處理時(shí)還采用乙醇等有機(jī)溶劑來(lái)提高絲素蛋白的交聯(lián)程度。在成膜過(guò)程中固化溫度與時(shí)間,以及后期固化劑的選擇,對(duì)絲素膜中結(jié)晶區(qū)所占的比例,以及結(jié)晶區(qū)中難以酶解的β化構(gòu)象的比例,起著至關(guān)緊要的作用[11]。

由于這兩個(gè)比例對(duì)絲素膜的機(jī)械性能甚至對(duì)藥物的緩釋速度都有極為重要的影響。因此,要根據(jù)具體情況來(lái)控制不同應(yīng)用方向的絲素膜的成膜條件,以便在生物降解速度與膜機(jī)械性能的維持或藥物緩釋速度之間尋求一個(gè)比較好的平衡點(diǎn)。但目前,對(duì)于絲素膜的降解主要是研究考察了其分子結(jié)構(gòu)與膜結(jié)構(gòu)與孤立于生物體外,在酸堿酶作用下的降解,少量亦涉及到其分子結(jié)構(gòu)與消化吸收的關(guān)系,對(duì)其在體內(nèi)非消化器官中的體液接觸下的降解及藥物負(fù)載與緩釋機(jī)制則尚不清楚,從而影響了其在人工血管,非口服的藥物載體等方面的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。

而且對(duì)于生物降解高分子,最重要的指標(biāo)是生物降解速度的控制,對(duì)于應(yīng)用于生物體內(nèi)的材料來(lái)說(shuō),這不僅取決于與之接觸體液的化學(xué)構(gòu)成,也與溫度、力學(xué)環(huán)境等生物物理因素有關(guān)。由于導(dǎo)致絲素蛋白降解的主導(dǎo)因素是酶,而據(jù)研究表明,蛋白的構(gòu)象在流場(chǎng)剪切力的作用下可發(fā)生變化,從而影響底物與催化劑的結(jié)合,使反應(yīng)速度受到影響[12]。因而在心血管系統(tǒng)的器官中,復(fù)雜的體液流場(chǎng)因素對(duì)材料降解的影響尤為重大[13-15]。為此,筆者已著手在綜合運(yùn)用生物化學(xué)與生物流變學(xué)的觀點(diǎn),通過(guò)設(shè)計(jì)體液流場(chǎng)、溫度等物理環(huán)境模擬系統(tǒng),對(duì)血管與骨膜兩類絲素膜較有潛力發(fā)展人工替代物的器官環(huán)境下,膜結(jié)構(gòu)、體液成分、體液溫度、體液流場(chǎng)變化等因素與絲素蛋白降解的關(guān)系進(jìn)行研究,以期全方位的深入了解絲素在體降解的機(jī)制,為拓展絲素在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用提供進(jìn)一步的理論基礎(chǔ)。