微膠囊在生物醫學的作用范文
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1微膠囊的制備
1.1材料
材料是決定微膠囊性能的關鍵因素之一.一般要求其成膜性能好，與包封物不發生反應，而且應具有一定的機械強度、穩定性;對于生物環境中應用的微膠囊，材料還要具備很好的生物相容性;有些情況下(如藥物控釋)則需要具有生物可降解性.目前研究報道中使用的微膠囊材料主要有天然、半合成和合成高分子3大類數十種。天然材料一般無毒、免疫原性低、生物相容性好、可降解且產物無毒副作用，是最常用的微膠囊制備材料，其中海藻酸鹽、殼聚糖等天然多糖資源豐富、制備簡單、價格便宜，極具開發潛力.合成材料一般化學穩定性和成膜性好，應用研究較多的主要是乳酸/乙醇酸共聚物，它是目前惟一獲準可用于人體的一類合成控(緩)釋制劑材料122].將天然材料與合成高分子混合作為微膠囊材料，既利用合成材料彌補天然材料強度上的不足，又利用天然材料彌補合成材料生物相容性較差的缺點，典型代表是海藻酸鈉/聚賴氨酸微膠囊l4]，在動物實驗中使用這種微膠囊包埋不同細胞形成的“人工細胞”取得了良好的治療效果.
1.2方法
chang[2l于1957年首次報道了乳化、噴霧干燥和靜電法3種微膠囊制備方法以來，微膠囊制備的新方法、新技術一直是眾多研究者的方向之一目前已形成化學法、物理化學法和物理法3大類多種制備方法(表2).圖2是對80年代以來研究報道中所使用的微膠囊制備方法的統計結果.研究者多以溶劑蒸發法、相分離法、界面沉積法和噴霧干燥法等物理化學法以及聚合法和乳化法等化學法制備微膠囊.這些方法通常需要高溫條件，或者使用破壞性有機溶劑，而且反應劇烈，對于那些日用化工行業中內含物性質較穩定的體系而言基本上沒有不良影響.然而這些條件很難滿足醫藥工業和生物技術領域中保持生物物質活性的要求.
另外，一般應用中要求微膠囊尺寸均勻，即具有較窄的粒徑分布，而上述方法制備的微膠囊通常粒徑分布寬，需要篩分過濾，增加了工藝步驟和設備投資.靜電法通過電場中離子型物質間反應制備微膠囊，過程比較溫和.然而應用并不普遍，主要原因是該方法規模小，產量通常為每小時數十毫升，而且微膠囊粒徑在200林m以上，不能滿足對小粒徑微膠囊的需要.Lencki等人123]以離子型多糖物質為材料，提出了乳化/內部凝膠化方法，即以海藻酸鹽和難溶鈣鹽混合懸浮液為分散相，以含有酸的油相為分散介質，形成乳化液，利用酸溶解難溶鈣鹽釋放出Ca2+，ca2+再與海藻酸鹽生成海藻酸鈣凝膠珠，實現了較溫和條件下小粒徑微膠囊的規模生產.Benedetti等人〔24]利用超臨界流體技術制得粒徑小于20林m，甚至平均直徑只有0.5林m的微粒，并指出了該方法在制備藥物釋放體系中的應用前景.他們發現:超臨界反溶劑CO:為連續流體時，導致微粒聚結和纖維結構的形成，而為間歇流體時則形成球形微米粒子;溫度實際上對粒子的形狀和尺寸影響并不顯著;而溶質濃度越高，生成的粒子聚結程度越低.Nakashima等人[25]制備出一種微孔玻璃膜(SPG)，采用膜乳化方法制備出單分散性乳化液滴.
受此啟發，Muramatsu等人1261以白蛋白溶液為分散相，含有表面活性劑的煤油為分散介質制備出尺寸均一的乳化液滴，再經過加熱使之變性固化得到白蛋白微球.研究發現，加熱變性過程并不影響微球單分散性;白蛋白濃度越高，微球尺寸分布越寬，而濃度較低易形成非球形粒子;另外較高的變性溫度利于形成較小的粒子.眾多研究均表明就單分散性來說，膜乳化法優于任何傳統的方法，而且通過選擇膜孔徑可以控制微膠囊的尺寸.
2微膠囊結構與性能的表征
2.1微膠囊膜結構及表面性質微膠囊膜結構及表面性質的表征對了解微膠囊膜滲透性具有重要作用.利用傳統的光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡(SEM)lz7]可以觀測微膠囊形態、大小、膜厚、表面及斷面顯微結構.近年來，出現借助現代儀器分析方法開展微膠囊膜結構及表面性質的研究報道.Levy等人[28，29〕利用Fourie:變換紅外光譜(FTIR)分別考察了人血清白蛋白與對苯二酞氯表面交聯制備微膠囊過程中pH(5.9一11)、交聯反應時間(2一60min)對表面配基、醋基、梭基等功能團吸收峰的影響.pH升高導致配基和醋基峰增強而梭基峰減弱，且在pH=9時得到表面粗糙直徑<巧林m的微膠囊;微膠囊進一步在pH=7.5緩沖液中浸泡導致配基消失而梭基增強醋基減弱，相應的微膠囊膜表面變得光滑，直徑明顯增大.延長反應時間導致酷基、醉基峰增強而梭基峰減弱，反應2min得到形狀很好的球形顆粒，凍干后為表面光滑完整的卵形顆粒;反應5min后為表面粗糙的球形顆粒，且時間越長，膜表面粒狀物越多.
xu等人l30]利用原子力顯微鏡(AFM)對處于液體環境中的微膠囊表面三維形態進行了觀測，考察了表面不同摩爾比的反凝膠和凝膠離子(Na+/caz+)對其表面形態和粗糙度的影響.Na+/eaZ+比值越高(分別為0.921，2.520.6，4.5/0.6)，微膠囊表面垂直方向最大高度(Zmax)越低(相應為488，369和263nm);且比值為0.9/1，2.510.6的樣品表面有皺縮，4.5/0.6的樣品則是光滑的，而光學顯微鏡僅觀測到0.9/1的樣品有皺縮，無法區分后兩個樣品.我們使用兩個參數，平面在垂直方向的偏離度(Ra)及其平方根(RMS)，對微膠囊表面粗糙度進行了定量評價，結果對應于Na+/ca2+比值升高，R。和RMs均降低，即微膠囊表面粗糙度降低.Asaki等人[3’]制備了含有海藻酸作為水溶性大分子配基的聚酞胺微膠囊，萃取銅、鉆、鎳、銀等金屬離子，實驗中發現不僅微膠囊內部的配基，而且微膠囊膜本身都能夠吸附累積金屬離子.他們利用X射線光電子譜(XPS)分析了微膠囊表面組成，發現海藻酸配基的一些功能團穿過微膠囊膜分布于表面，所以膜表面也能富集金屬離子.
2.2微膠囊的物理化學性能
微膠囊膜具有保護膜內物質和控制膜內、外物質跨膜傳遞的雙重作用，是微膠囊物理化學性能的決定因素.膜強度和膜滲透性是通常用于表征微膠囊膜物理化學性能的主要參數.
2.2.1微膠囊膜強度膜強度大小決定了微膠囊在生物環境停留期間能否保持基本完整，從而保證囊內細胞或物質活性，是微膠囊的重要性能之一，但至今仍未建立微膠囊膜強度的直接測試方法.Jay等人[32l采用泡形彈性計對含有血紅蛋白的聚己撐癸二酞胺微膠囊的膜強度進行了定量研究，他將與可調水銀柱相連通的微量滴管伸到懸浮在水中的微膠囊表面上，通過改變汞柱高度的方法將膜的小舌吸人微量滴管內，測定膜表面張力，從而表征膜強度.zhang等人[33}把測定細胞強度的微控制方法引人微膠囊膜強度的測定研究，即將微膠囊置于兩水平探頭間，采用擠壓方法測定破碎微膠囊所需的破碎力.
測得典型微膠囊的破碎力一般在5一20林N，而且還給出了單個微膠囊的直徑.一般認為，微膠囊膜強度是膜厚和膜彈性的綜合結果，而相同條件下制備的微膠囊，其膜強度與膜厚之間成正比關系，所以通過對微膠囊膜厚的評價即可定性地表征微膠囊膜的強度.馬小軍等人134}在假設微膠囊尺寸均勻和膜內液體密度D;與微膠囊密度Dw相等的情況下，建立了微膠囊濕態膜厚的定量計算方法:L=R{l一[(Ww一Wm)/Ww]113}，通過實驗手段測定微膠囊總重Ww，微膠囊濕態膜重硯n和微膠囊平均半徑R，即可確定微膠囊濕態膜厚L，從而定性表征膜強度.而且，他們還發現:微膠囊制備過程中體積膨脹率與膜厚之間成反比關系，進而可以推出體積膨脹率與膜強度成反比關系，定義體積膨脹率為S(%)=100[(V(膠囊)一V(膠珠)/V(膠珠)]，通過實驗手段測定微膠囊體積V(膠囊)和膠珠體積V(膠珠)，即可計算出體積膨脹率，同樣可定性表征膜強度.
2.2.2微膠囊膜滲透性膜的滲透性是微膠囊的另一重要性能，尤其對于生物環境中應用的微膠囊來說，了解膜滲透性更為重要.生物環境中營養物質能否擴散進入微膠囊，細胞代謝產物能否擴散出微膠囊，微膠囊能否隔離具有殺傷性的抗體等性能都將影響微膠囊內生物物質的活性.因而膜的滲透性是決定微囊化技術能否用于臨床移植治療或細胞培養的關鍵.目前，國際上普遍使用截留分子量[35]，即不能透過微膠囊膜的蛋白質的最低分子量，來衡量微膠囊的滲透特性.但是，截留分子量只反映了微膠囊膜對不同分子量溶質的阻隔能力，不能反映低于截留分子量的各種溶質的滲透速率等特性，因而它作為表征微膠囊膜滲透特性的手段顯得不夠準確也不夠全面.Jalsenjak和Un。等人[36，’7]建立了平板膜模型，使用滲透率來衡量微膠囊膜的滲透性，分別利用NaCI擴散進人水相分離法制備的明膠一一阿拉伯樹膠微膠囊以及苯巴比妥擴散進人乙基纖維素微膠囊的實驗數據對模型進行了驗證，認為物質擴散通過微膠囊膜的機理主要是溶解一擴散作用.Kwok等人138}建立了海藻酸鈉/聚賴氨酸微膠囊的物質擴散模型，對物質跨膜傳遞現象作了理論預測.他們利用牛血清白蛋白擴散實驗數據與模型計算所得擴散系數進行了對比，結果比較吻合.解玉冰等人139〕綜合膜分離技術中表示超濾、微濾和透析過程分離透過特性的物化參數，使用膜相擴散系數、截留率、截留分子量等參數較為全面地表征了微膠囊膜的滲透性，并建立了非穩態球形滲透擴散模型，從理論上對微膠囊膜的物質傳遞特性進行了分析，認為APA微膠囊內外物質擴散阻力主要集中在膜上.
進而利用葡萄糖擴散進人海藻酸鈉/聚賴氨酸微膠囊的實驗數據擬合，求算出其膜相有效擴散系數，從而對葡萄糖的膜內濃度分布有所了解.何洋等人140」在非穩態球形滲透擴散模型基礎上，提出膜擴散阻力特性參數和膜內基質分配系數，重新建立了蛋白質在APA微膠囊中的擴散數學模型.該模型一方面消除了原模型在編程差分擬合中需調整初值以防結果發散的問題，利于大批數據處理;另一方面清晰地反映出制備條件對物質擴散性質的影響，為APA微膠囊制備條件的優化提供了重要的理論依據.但是上述基礎研究大都是對微膠囊膜性能初步的、靜態的表征，相關的應用環境中微膠囊膜行為動態過程規律的研究是相對薄弱的一環，這一方面的研究工作有待加強.
2.3微膠囊生物相容性
對于生物環境中應用的微膠囊來說，其主要目的是保護并運載生物活性物質或細胞進入生物體內發揮一定的功能，因而其材料除應具備一定的物理化學性能外，還必須具備生物相容性，即材料在特定應用環境中，引起適當宿主反應和產生有效作用的能力.它決定于材料和活體系統間的相互作用，要求材料盡可能不引起生物體異常反應(如炎癥、過敏等)，生物體對材料性能也不產生較大影響(如強度降低、老化等).Mille:等人14’l通過體外細胞培養和動物體內模型考察了組織/材料界面的細胞相互作用，發現一些材料能不同程度地激活單細胞/巨噬細胞分泌具有不同生物活性的蛋白質，如白細胞介素一1和一種促纖維細胞增殖及膠原質合成的調節因子，而正是這些物質在宿主反應中起了決定性作用.
Gin等人[’2〕分別考察了植人大鼠腹腔和脾臟的聚丙烯酞胺微膠囊的生物相容性.微膠囊在整個20周植人期內每4周回收檢測一次，結果發現腹腔中微膠囊保持很好的獨立性，而脾臟中的微膠囊引起了輕微的炎癥反應，進而發現這是微膠囊吸附了纖維細胞并促進其生長的結果.研究表明，在微囊化Langerhans胰島細胞移植實驗中囊周宿主反應常最終導致移植失敗.Robitaille等人143〕將海藻酸鈉/聚賴氨酸微膠囊移植人大鼠附翠脂肪墊，考察了細胞因子在宿主反應機理中的作用.在移植14d后檢測了轉生長因子p，(TGF一p，)基因的表達情況，發現在囊周浸潤物包含的細胞中細胞因子TGF一plmRNA水平明顯高于非移植組織細胞和鹽水注射組織細胞中的水平.這表明TGF一p，在宿主反應中起了一定的作用.
同樣的方法可用于研究其他成纖維細胞因子的作用機理，從而可通過控制其水平而控制囊周宿主反應，以獲得理想的移植效果.由于生物相容性的研究涉及多學科交叉的綜合性因素，是十分復雜的，所以人們對生物相容性的認識基本上還是經驗性的.如何從本質上認識生物相容性問題，進而指導成膜材料的選擇仍將是微膠囊研究中的主要課題之一。
3微膠囊在生物醫學領域的應用研究
3.1在臨床醫學中的應用研究
人體器官和組織缺損或衰竭正日益成為威脅人類健康乃至生命的突出問題.同種或異種器官移植是世界醫學界對付器官衰竭的主要手段，當前心臟和腎臟等器官整體移植手術的成功率已經相當高，挽救了許多患者的生命.但是供體來源有限和機體免疫排斥反應限制了其應用和發展.在器官供體來源嚴重匾乏的情況下，人們研制了人工器官，即人造的裝置或機器(如人工心臟和人工腎)，它們可以替代人體有缺陷的部位，完成復雜的任務以維持生命.
另一方面，糖尿病、帕金森氏癥、早老性癡呆、肝功能障礙、甲狀腺功能減退和侏儒癥等神經/內分泌系統疾病則是部分組織細胞功能喪失引起的，如糖尿病是因為患者自身免疫系統選擇性地破壞了分泌胰島素的胰腺細胞，導致胰島素分泌不足，血糖水平升高130].對此類疾病目前尚無法實現相關的整體器官移植，只能期望通過組織細胞水平移植得以治療.這時裸露的組織細胞移植人體內又將遇到強烈的機體免疫排斥反應.微膠囊則依靠膜的隔離保護性能和選擇透過作用，可以保證生物活性物質擴散通過，抗體或免疫細胞被截留隔離，從而在生理上避免了個體的免疫排斥，成為解決組織細胞移植過程免疫排斥問題的理想手段，因而引起眾多研究者的興趣.繼糖尿病大鼠模型取得進展之后，sun等人147}實驗室又進行了靈長類糖尿病動物模型的研究.他們將APA微囊化豬胰島細胞移植人9只自發性糖尿病猴的腹腔中，7只病猴在不注射胰島素的情況下維持正常血糖水平4個月以上，最長達804d.進一步檢測發現受試猴體內葡萄糖清除率和胰島素分泌量明顯高于移植前.血糖正常3個月后從兩只病猴體內回收得到完整的微膠囊且沒有細胞過度生長的跡象，囊內胰島清晰可見.
而且移植人體內長達兩年的微膠囊對兩只病猴器官無不良影響.薛毅瓏等人149]以右側帕金森氏癥病樣大鼠和猴為模型，分別將APA微囊化和非微囊化牛腎上腺嗜鉻細胞(BCC)及空微囊定向植人右側腦紋狀體內，結果表明植人的微囊化BCC能在動物腦內存活、分泌多巴胺(一種神經化學信號物質，帕金森氏癥就是中腦黑質多巴胺能神經元變性減少，不能正常分泌多巴胺造成的)等單胺類物質并糾正帕金森病樣大鼠和猴的異常行為(偏側旋轉)，作用超過10個月.非囊化BCC僅能改變部分動物的偏側旋轉，且作用時間基本只能持續1個月;空微囊組則與對照組模型一樣，癥狀沒有改善.甲狀腺功能減退癥是由多種原因引起的甲狀腺激素(TH)合成、分泌或生物效應不足所致的一種內分泌疾病.其中占90%以上的是由免疫反應或病毒感染、放療和缺碘等引起的甲狀腺組織破壞.吳美慧等人150〕以甲狀腺功能減退大鼠為模型，進行APA微囊化和非微膠囊化豬甲狀腺組織移植治療.微囊化甲狀腺組織顯著提高了受體T3，T4水平，降低了促甲狀腺激素(TSH)水平且作用持續超過40周，且微膠囊回收率100%，回收的微囊化甲狀腺組織存活率達80%.
非囊化甲狀腺組織在初期也明顯改善了上述指標，但9周后均回復到了移植前的水平.上述臨床前動物研究均表明:采用一定材料、方法制成的微膠囊本身并不具備治療疾病的作用，但能保證囊內包埋的細胞存活且正常代謝、應答式分泌有效物質，如胰島素、多巴胺和甲狀腺激素等，從而達到治療疾病的目的;微膠囊膜的選擇透過作用可以保證細胞分泌的有效物質擴散進人生物體內發揮生理功能，而將免疫球蛋白等抗體阻隔在囊外，避免了異種移植中最棘手的免疫排斥問題.臨床應用的主要技術問題一是獲取高產量、高活性、高純度的供體組織細胞;二是作為免疫隔離工具的微膠囊材料的生物相容性;三是微囊化細胞的大規模培養和保存.
3.2在生化藥物控制釋放中的應用研究
蛋白質和多膚類大分子生化物質(如生長激素、胰島素、肝素、干擾素、白細胞介素等)由于在侏儒癥、糖尿病、肝硬化以及許多癌癥等難以治愈疾病的治療過程中表現出藥理作用強、副作用少且很少引起過敏反應的特點而備受重視.另一方面，重組DNA技術的出現使得具有療效的蛋白質的規模生產成為現實15’〕.然而由于此類生化藥物穩定性差，采用傳統口服給藥后在人體胃腸道內易被酶降解，所以目前多限于注射給藥，如胰島素在其被發現75年之后仍只是以注射途徑治療糖尿病[52〕.另外，此類藥物體內半衰期短，以至于不得不多次注射以維持療效.此外在非保護狀態下這類藥物的生物利用度通常很低(<5%)，不能獲得滿意的療效.所以，開發適于蛋白質和多膚類生化藥物的釋放體系已成為重要的研究方向.
微膠囊膜能最大程度地保持囊內生化物質活性，且通過調節制備條件可以控制微膠囊膜的厚度和孔尺寸，從而實現囊內生化藥物的控釋或緩釋.Redding等人1531將黃體激素(LHRH)包埋于乳酸一乙醇酸共聚物(PLGA)微膠囊中，采取肌肉注射途徑實現該膚在大鼠體內持續釋放30d以上，顯著降低了雄激素依賴型前列腺瘤的重量和體積，成功抑制了大鼠血清中肇酮水平，而且效果優于每天皮下注射等量或雙倍劑量的未包囊激素.纖維原細胞生長因子具有刺激細胞生長和組織修復的功能，傳統的基于聚合物基質的釋放體系雖然能實現緩釋，但其99%的分裂活性將喪失.Edelman等人154]將其與肝素一瓊脂糖凝膠珠鍵合以便于長期穩定保存，再以海藻酸鈉包囊，然后在肝素酶酶解斷鍵作用下實現了該因子以活性狀態的控制釋放.Johnson等人155]將重組人生長激素包埋于PLGA微球中，經皮下注射人大鼠和恒河猴體內，實驗結果表明微囊化激素性質穩定，動物血清中重組人生長激素維持高水平達30d以上，是等量該激素以溶液形式經皮下注射后維持時間的20倍.Takada等人f56}設計了leuprorehn的微膠囊控制釋放體系，以大鼠和狗為動物模型，一次注射即可實現3od內維持血清中穩定的leuprorelin水平.
該微囊化leuprorelin對前列腺癌、子宮內膜異位及性激素依賴型疾病的臨床療效已在60多個國家得到了證實.Isobe等人157]將重組人骨形成蛋白包埋于乳酸一乙醇酸共聚物微膠囊中并移植人大鼠皮下，經組織化學檢測發現隨著骨形成蛋白的釋放，具有堿性磷酸酶活性的骨誘導細胞出現在膠囊周圍，而且在異位骨誘導形成過程中并不生成軟骨，該結果表明骨形成蛋白的作用是誘發間質細胞分化為成骨細胞.另外對干擾素158〕、促甲狀腺素[59]、人類免疫缺損疫苗L60]等物質釋放體系的研究結果均表明微膠囊(微球、微粒)可以起到控(緩)釋作用，保護了藥物的生物活性，延長了半衰期，提高了穩定性，不同程度地提高了藥物的生物利用度.臨床應用的主要技術問題一是如何更好地保持囊內蛋白質的生物活性;二是作為控制釋放載體的微膠囊材料的生物相容性;三是開發條件溫和且易于規模化生產的微膠囊制備技術.
4展望
微膠囊包埋組織細胞或生化藥物的臨床前研究已經向人類展示了美好的應用前景，相信隨著化學、化工、材料、生物和醫學等學科領域的不斷結合與發展，微膠囊技術研究必將取得重大進展.滿足不同應用環境需求的材料開發及加工和改性技術日趨成熟，條件溫和且易于規模化生產的制備技術及專項儀器與設備的開發成功將為微膠囊的臨床應用提供更加有力的技術支持;
對微膠囊制備條件一膜結構一性能的關系，應用環境中的動態行為變化規律，膜內外物質傳遞規律以及生物相容性的化學本質的認識更加深入，將為微膠囊的臨床應用奠定堅實的理論基礎.在基礎研究的推動下，微膠囊的應用研究也將進人快速發展時期.未來5一10年內，微囊化人工細胞(人工器官)移植治療帕金森氏癥、糖尿病等神經/內分泌系統疾病有望進人臨床實驗;
若干種微囊化生化藥物、抗癌藥物和伴終身類藥物控釋體系實現產業化;微囊化人工細胞及獲取其代謝產物為生化藥物的應用將進一步推動細胞培養技術的發展.同時微膠囊有望成為基因的運載工具，推動基因治療的臨床應用，如微囊化重組神經生長因子治療老年性癡呆，微囊化重組人生長激素基因治療侏儒癥等.另外與微膠囊有關的生物材料的其他臨床應用，如眼球填充用人工晶體，愈合性腦組織外膜、促牙蘸外周組織生長用膜等以及微膠囊在生化分離、香精、香料和農藥、化肥等其他領域中的研究和應用都將有所突破.