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【摘要】目的觀察茶皂素對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用。方法采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，以茶皂素灌胃給藥，觀測其對腦缺血大鼠的神經行為、腦組織超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合酶(NOS)活性及一氧化氮(NO)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)含量的影響。結果茶皂素能明顯改善腦缺血大鼠的神經行為，拮抗腦缺血再灌注引起的SOD活力的下降及ROS、MDA含量的升高，并使腦缺血大鼠的腦組織中NO及NOS水平明顯下降。結論茶皂素對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷具有很好的保護作用。
【關鍵詞】茶皂素局灶性腦缺血自由基一氧化氮
【Abstract】Objective:ToobservetheprotectiveeffectofteasaponinonFocalcerebralischemia-reperfusioninjury.Methods:Makefocalcerebralischemia-reperfusionmodelofratbysuture,deliveryteasaponinbyIg.Toobservetheinfluenceofteasaponintoneurobehavioralandbrainsuperoxidedismutase(SOD),nitricoxidesynthase(NOS)activityandnitricoxide(NO),reactiveoxygenspecies(ROS),malondialdehyde(MDA)contentincerebralischemiarats.Results:Teasaponincanimproveneurobehavioralincerebralischemiaratsobvious-lyandantagonistcerebralischemia-reperfusion-induceddeclineinSODvitalityandROS,MDAcontentincreasedandmakethelevelsofNOandNOSdecreasedobviouslyinbraintissueofcerebralischemiarat.Conclusion:Teasaponincanprotecttheratswithfocalcerebralischemia-reperfusioninjuryverywell.
【Keywords】TeasaponinFocalcerebralischemiaFreeradicalsNitricoxide
茶皂素(Teasaponin：TS)是從茶樹中提取的一種五環三萜類植物皂甙，由配基、糖體和有機酸三部分組成，存在于茶籽、茶葉、茶根等各個部分，具有多種生物活性。據報道[1]，茶皂素有明顯抗炎、抗滲透、抗菌、化痰、止咳、鎮痛等作用，而且有防止高血壓、高血糖及化痰止咳的作用。目前，對茶皂素關于腦缺血再灌注損傷的研究報道較少。本實驗旨在建立動物腦缺血再灌注模型，觀察茶皂素對實驗性大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用。
1材料
1.1茶皂素的制備[2～3]挖取5年以上樹齡的茶樹根，洗凈，切片，烘干，粉碎成粗粉，按料液比l：4加80%乙醇進行超聲波法提取。工藝參數：超聲波頻率為20kHz，提取時間為20min，提取溶液溫度為50℃。所得提取液經大孔吸附樹脂層析、乙醇洗脫、脫色劑處理后，濃縮烘干，得到茶皂素。產品接近白色，純度達92.8%-93.1%。在空氣中放置不吸潮、不變色。
1.2試劑與儀器R0S、SOD、MDA、NO、NOS及考馬斯亮藍試劑盒均為南京建成生物工程研究所產品：SC-302超聲波清洗儀（上海波龍設備有限公司），TGL-16型高速臺式離心機(上海醫用分析儀器廠生產)，722-型分光光度計(上海精密科學儀器有限公司生產)。
1.3動物SD大鼠60只，雌雄各半，重250~300g，由湖北省實驗動物中心提供。
2方法
2.1大鼠局灶性腦缺血模型的制備(MCAO法)[4]SD大鼠共60只，分2批，第1批用于觀察神經行為；第2批用于觀察腦組織SOD、NOS活力及ROS、MDA和NO含量的變化。每批分為3組，即假手術組、模型組和茶皂素組，每組10只。各組動物均于手術前灌胃給藥3d，每天1次，其中茶皂素組給予茶皂素(0.5g/kg.bw)，假手術組及模型組均灌胃給予等體積的生理鹽水。第3天給藥后20min，采用頸內動脈線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)模型。將大鼠用20%的烏拉坦(1g/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定在手術臺上，頸部正中切口，分離右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，暫時夾閉頸總動脈、頸外動脈，在頸總動脈分叉下方剪一切口，將一預先用酒精燈燒成圓頭的尼龍線(直徑為0.26mm)插入頸內動脈至大腦中動脈起始端，進線深度距頸內、頸外動脈分叉處18～20rnm左右可感到阻力，阻斷右側大腦中動脈血流。2h后抽出尼龍線，扎緊動脈殘端，縫合皮膚，予以再灌注24h。假手術組大鼠麻醉后，僅暴露頸內外動脈分叉，不閉塞MCA。
2.2神經病學評分第1批大鼠采用5分制評分標準[5]，分別于缺血再灌注后3h、6h、12h、24h進行評分。0分=無神經損傷癥狀；1分=不能完全伸展對側前肢；2分=向外側轉圈；3分=向對側傾倒；4分=不能獨自行走，意識喪失。
2.3生化指標的測定第2批大鼠再灌注24h后，處死大鼠，迅速取腦稱重。用生理鹽水制成10％腦組織勻漿液，低溫離心，取上清液，按試劑盒說明書分別測定大腦組織中SOD、ROS、MDA及NO、NOS含量。按考馬斯亮藍法標定蛋白含量。
2.4統計學處理實驗數據采用SPSSFORWINDOWS10．0軟件進行t檢驗統計處理。
3結果
3.1茶皂素對局灶性腦缺血大鼠神經功能的影響造模后，連續觀察3h、6h、12h、24h，進行大鼠神經功能缺損評分。與假手術組比較，各造模組在四個時間點均出現明顯的神經功能缺損(P＜0.01)，有統計學意義。且茶皂素組不同時段的積分均低于模型組，在缺血再灌注3h、6h、12h茶皂素組評分降低明顯(P＜0.05)，有統計學意義。
3.2茶皂素對局灶性腦缺血大鼠腦組織ROS、MDA、SOD的影響MCAO大鼠腦組織中SOD活性較假手術組明顯減少，ROS、MDA含量明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，茶皂素組能不同程度的改善腦損傷，抑制腦組織ROS、MDA的產生，提高SOD活性，差異顯著(P<0.05)。
3.3茶皂素對局灶性腦缺血大鼠腦組織NO、NOS的影響MCAO大鼠腦組織中NO含量及NOS活性較假手術組明顯增加；與模型組比較，茶皂素組能不同程度的改善腦損傷，抑制腦組織NOS的活性，減少NO的含量。4討論
缺血性腦血管疾病是臨床的常見病和多發病。近年來研究發現，腦缺血再灌注損傷與NO、氧自由基等有關。腦內NO的作用是雙重性的，其既有腦保護作用，又有神經毒性作用[6]。低濃度NO由于能擴張血管、抑制血小板聚集與粘附，可使谷氨酸調控的離子通道下調，防止細胞內鈣超載，因而對細胞有保護作用；但在高濃度下，NO對細胞有損傷作用[7]。本實驗結果也顯示，大鼠在腦缺血再灌注24h時，腦組織NO含量及NOS活性均明顯升高，而茶皂素能明顯降低腦缺血再灌注大鼠腩組織NO含量和NOS活性，表明茶皂素對大鼠腦缺血再灌注有保護作用。
自由基能夠攻擊腦細胞膜的不飽和脂肪酸，使之發生脂質過氧化反應，細胞膜結構受到破壞，使膜的通透性增加，從而導致組織水腫、壞死，細胞結構和功能遭到破壞。茶皂素可明顯提高MCAO大鼠腦組織中SOD活性，減少脂質過氧化產物ROS、MDA的生成，表現其抗氧化特性，對保護細胞膜免受自由基的損害起著積極作用。本實驗在局灶性腦缺血再灌注模型上進一步研究發現，茶皂素能有效的改善MCAO大鼠再灌注后3h、6h、12h、24h出現的行為功能障礙及神經功能缺損，提高肌張力。
因此，我們認為茶皂素對局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用可能與其顯著的抗組織自由基損傷及抗NO神經毒作用有關。
參考文獻
[1]張星海，楊賢強．茶皂素性質及應用研究近況[J]．福建茶葉，2003,2．
[2]劉昌盛，黃鳳洪，夏伏建，等．超聲波法提取茶皂素的工藝研究[J]．中國油料作物學報，2006,28(2):203-206．
[3]唐明遠，盧向陽，屈姝存，等．茶皂素制備新工藝[J]．湖南農業大學學報，2000,2,26(1):66.
[4]馮亦璞，閏超華．腦缺血實驗．見：張均田主編．現代藥理空驗方法(下冊)．
[5]LongaEZ，WeinsteinPR，CarlsonS，eta1．Reversiblemiddlecerebralarteryocclusionwithoutcraniotomyinrats[J]．Stroke，1989；20(1)：84-91．
[6]LiplonSA,ChoiYB,Pan，ZII，eta1．Aredox-basedmechanismfortheneuroprotectiveandneurodestructiveeffectsofnitricoxideandrelatednitrosocompounds[J]．Nature，1993；364-626．
[7]萬敬枝，程夢琳，吳基良，參附注射液對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織NO、MDA含量和SOD活性的影響[J]．中國中醫急診，2004,13(6)：381-383．