初探藥證對應的機制范文

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類風濕性關節炎(rheumatoidarthritis，RA)是一種慢性自身免疫性疾病，存在多基因、多通路、多途徑的分子功能網絡相互作用的復雜病理過程［1-2］。RA屬于中醫的“痹證”范疇，其證候多樣，但寒、熱證候屬性特征最為明顯，在臨床辨證論治中的價值也最大［3］。辨證施治、“藥-證對應”是中醫的基本治則，雖然已有大量RA中醫治療的臨床和實驗報道，但RA“藥-證對應”的分子機制尚不清楚。隨著基因組學、蛋白組學、系統生物學的發展，網絡藥理學(NetworkPharmacology)應運而生，它在網絡生物學與多向藥理學的基礎上提出的藥物設計的新思想［4-5］。研究中藥多靶點的藥理作用機制及復雜疾病網絡，最有可能揭示辨證施治的分子基礎。本研究基于網絡藥理學，應用文本挖掘和生物信息學技術，以RA熱證為切入點，通過構建、分析RA熱證的分子生物網絡以及對證中藥的藥物靶標網絡，尋找RA熱證“藥-證對應”的靶標網絡和生物學通路，初步探索RA熱證“藥-證對應”的分子生物學基礎。

1方法

1．1基于RA熱證的對證中藥定向文本挖掘文本挖掘分為文本數據收集、處理、結構化分析、可視化以及評價5個步驟［6］。首先，登錄中國生物醫學文獻數據庫，檢索關鍵詞“類風濕關節炎OR類風濕性關節炎”。文獻14435篇(檢索日期:2011年9月15日)。將收集來的數據，以ANSI編碼格式保存。利用文本提取工具，對下載的非結構化的TXT文本數據進行信息提取，保存成格式化的、便于數據庫(Access)和大型數據庫(MicrosoftSQLServer，SQL)處理的格式。通過關鍵詞對構造算法［7］進行數據清洗工作。然后結合專業知識進行解析，繼續按關鍵詞對構造算法進行噪音清洗，直到噪音降到滿意為止。然后，結合中醫證候要素特點進行定向文本挖掘，在RA數據集內，按照“熱”為關鍵詞對文獻的主題詞進行檢索，將數據集定義為“熱”子集。然后，針對這個數據子集，分別執行后續的計算［7］。經過計算，可以得到中醫治療RA熱證要素的中藥用藥規律。用可視化軟件Cytoscape2．8．2進行可視化處理，并以網絡圖的形式展現出來。

1．2PubChem數據庫搜索藥物靶蛋白將定向文本挖掘出的對證治療RA熱證的中藥分別輸入PubChem數據庫［8］檢索，找到每種有效成分的人類活性靶蛋白。

1．3基因芯片分析典型RA熱證與正常人外周血CD4+T細胞差異基因中日友好醫院門診病人中，隨機選取符合納入標準的早期RA女性患者，RA證候問卷表采集患者各項證候信息，參照相應標準進行寒、熱證候判斷，篩選出符合納入標準的RA女性熱證患者12名。同時按照排除標準選取中國中醫科學院12名健康志愿者(年齡在18歲至70歲之間)作為對照組。采集RA熱證患者及健康人空腹靜脈血，分離純化得到CD4+T淋巴細胞，用于基因表達譜芯片分析。比較RA熱證與正常人差異基因，選取1．4倍以上的上調及下調的差異基因分析，具體分析步驟見本課題組前期研究報道［9］。

1．4分別構建RA熱證對證中藥靶標網絡及RA熱證生物學網絡并進行對應分析利用IPA(IngenuityPathwayAnalysis)生物分析軟件，在線提交定向文本挖掘出的基于RA熱證對證藥物的靶蛋白列表及RA熱證與正常人差異基因列表。分別構建基于RA熱證對證中藥靶標蛋白的相互作用網絡以及基于RA熱證與正常人比較差異基因的相互作用網絡。利用軟件中的Network、CanonicalPathway、Functions及Comparison等功能模塊進行分析，獲得藥物靶標網絡功能及重要生物學通路。同時，比較藥物靶標網絡和RA熱證分子網絡，尋找和分析二者的生物學通路的異同。

2結果

2．1RA熱證定向文本挖掘結果通過定向文本挖掘，篩選出治療RA熱證的4個常用中藥:黃柏、知母、蒼術及牛膝，將其作為研究的對象，見圖1。

2．2RA熱證對證中藥靶蛋白及靶標網絡通過檢索PubChem數據庫，分別找到RA熱證的對證中藥:黃柏、知母、蒼術及牛膝4味中藥共有靶蛋白123個(略)。通過IPA軟件將這些靶蛋白構建RA熱證的對證中藥靶蛋白的相互作用網絡，見圖2A所示。經IPA分析，該網絡排名前5位的生物學功能見表1。

2．3RA熱證與正常人差異基因生物學網絡及功能RA熱證與正常人CD4+T淋巴細胞的差異基因中，上調基因15個，下調基因6個，詳見本課題組前期研究報道［9］。基于上述差異基因和IPA構建的蛋白質相互作用網絡見圖2B。經IPA分析，該網絡主要生物學功能見表2。

2．4RA熱證差異基因及其對證中藥靶蛋白的共同生物學通路在IPA系統的Comparison功能中，比較RA熱證差異基因及其對證中藥靶蛋白的共同生物學通路，發現在細胞免疫反應相關的信號通路中，二者都參與了共同的生物學通路:GM-CSF信號通路，CTLA4信號通路，T細胞受體信號通路及輔助T細胞中的CD28信號通路，如圖3～4所示。在圖4中，我們可以看到，這4條生物學通路中，RA熱證差異基因及其對證中藥靶蛋白都有參與，但作用的靶點并不盡相同。在GM-CSF信號通路中(圖4，A)，RA熱證與正常人比較，BCL2A1(Bfl-1)基因表達上調，而RA熱證對證藥靶點為GM-CSF信號通路中的AKT和Bcl-xL，這些分子最終共同干預細胞的存活及增殖。在細胞毒性的T淋巴細胞中CTLA4信號通路(圖4，B)、T細胞受體信號通路(圖4，C)及輔助T細胞中的CD28信號通路(圖4，D)中，RA熱證與正常人比較，上調了通路中的CTLA4基因，而對證中藥靶點為AKT和NF-κB，都通過信號通路的網絡影響到整個通路的生物學功能。

3討論

文本挖掘技術能以線性和非線性方式解析數據，且能進行高層次的知識整合，又善于處理模糊和非量化數據［10］。大量的中醫藥臨床報道積累了豐富的文本數據，為文本挖掘提供了充分的數據條件［7，11］。蛋白質相互作用網絡(Protein-proteinInteractionNetwork)是研究生物功能或病理變化分子基礎的新途徑和新方法，也是目前國際上生物信息學研究的熱點之一［12，13］。發現并建立與疾病相關的分子作用網絡，對于認識復雜疾病至關重要，也是現代生物醫學研究所面臨的重大挑戰［14］。網絡藥理學基本思路是理解疾病“表型-基因-靶點-藥物”相互作用網絡特征，通過網絡分析，觀察藥物對疾病網絡的干預與影響，尋找可能的組合藥物靶標，預測最優化的組合藥物［15］。

基于網絡藥理學關鍵技術研究，對于發現新藥、預測藥效及藥理機制既是方法學創新，又具有重要的社會、經濟效益［16］。RA屬于中醫中藥的優勢病種，“方-證對應”、“藥-證對應”是中醫藥治療的主流方向，研究中藥網絡藥理學相關的關鍵技術和方法有望直觀而深入地解釋中醫辨證論治的物質基礎。PubChem數據庫是由美國國立衛生研究院(NIH)建立的關于小分子生物活性的公共數據庫［17］。通過其中豐富的物質、化合物和生物活性信息，以及數據庫自身對這些信息進行整合分析的功能，檢索治療RA熱證的中藥，可以找到黃柏、知母、蒼術、牛膝共123個，作為我們構建熱證對證中藥靶標網絡的分子基礎。IPA8．7生物分析軟件［18］能夠分析、整合、理解來自于基因表達等系統生物學、組學等的實驗數據;能夠搜索到有關基因、蛋白質、化學品和藥物的信息，并能建立起實驗系統的交互模型。在本研究中，我們除了利用IPA平臺建立了RA熱證生物學網絡和熱證對證中藥靶標網絡，同時利用IPA軟件中ComparisonAnalysis分析功能對RA熱證對證中藥靶標網絡與RA熱證與正常人差異基因的分子網絡進行比較分析，發現二者網絡的異同點，以及二者生物學通路的異同點，進而尋找“藥-證對應”的生物學基礎。本研究結果顯示，RA熱證差異基因及其對證中藥靶蛋白的共同生物學通路，都參與了細胞免疫反應相關的4條共同的生物學通路:GM-CSF信號通路，細胞毒性的T淋巴細胞中CTLA4信號通路，T細胞受體信號通路及輔助T細胞中的CD28信號通路。這4條信號通路都是參與體內細胞免疫反應及炎癥反應等生命活動的重要生物學通路，在類風濕性關節炎的發生發展中起著關鍵的作用［19-21］。其中，一些通路的重要靶點，已經被研究者甚至美國FDA列為治療RA的靶標，如GM-CSF［21］，CTLA4［22］。RA熱證的疾病狀態和對證中藥的干預靶點，都能作用在相同的細胞信號轉導通路，干預通路中的相同或不同的關鍵分子，進而影響整個通路的生物學功能。這也許就是對證中藥治療RA熱證“藥-證對應”的分子生物學機制之一，但還需要進一步實驗驗證。

目前網絡藥理學剛剛起步，其研究手段、計算方法及應用軟件還處在探索階段［23］。基于大量數據庫和算法構建的分子網絡及藥物靶標網絡，具有一定的預測性，還需要進一步實證實驗的驗證。但無疑，網絡藥理學為探索中醫“藥-證對應”及辯證施治的生物學基礎開辟了一條高通量的途徑，并為開發基于證候的優化藥物組合、臨床用藥及新藥研發提供了新思路、新方法。