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編者按：本文主要從引言；材料和方法；結果；討論，對人源殺菌肽進行講述。其中，主要包括：人類惟一的cathelicidingene所編碼的蛋白質為hCAP18(humanCationicantimicrobialprotein18),LL37是Cthelincidin蛋白hCAP18C端的37個氨基酸片段,為Mr4.5×103的陽離子兩性分子α螺旋抗菌肽，其氨基酸殘基序列為LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES、材料BL21star菌、pET30a(+)，pMD18T和鼠抗6×HismAb購自ROCHE公司；DH5α菌由本研究所保存；ExTaq，SacⅠ，HindⅢ，Fxa裂解試劑盒購自TaKaRa公司；6×His親和純化TALON柱芯及強離子交換柱芯MacroPrepHighS分別購自Clontech公司和BioRad公司；改良殺菌肽LL37的DNA序列為本所構建.、1rLL37多肽融合表達質粒的構建將本所已構建的改良殺菌肽LL37的DNA序列經17g/L凝膠電泳、純化，以連接試劑盒（TAKARA）連接入pMD18T載體并轉入感受態DH5a菌中，鋪LB板（含Xgal0.04g/L，IPTG0.024g/L，Amp0.1g/L）進行藍白斑篩選，測序正確的單菌落進行擴增、抽質粒，并進行雙酶切（SacⅠ及HindⅢ）和凝膠電泳、純化、臨床抗生素的廣泛大量使用，導致嚴重的致病菌耐藥性問題.殺菌肽（又稱抗菌肽、肽抗生素）為一類廣泛存在于許多生物中的內源性殺菌多肽.其作用特點在于既不容易導致耐藥菌株的產生，又具有廣譜抗微生物作用，因而具有極高的應用價值，具體材料請詳見：
【關鍵詞】人源殺菌肽LL
【摘要】目的：將改良LL37多肽以融合肽形式表達、純化，并初步研究其殺菌活性.方法：將編碼改良的LL37多肽的DNA序列放入載體pET30a（+），轉入工程菌BL21star(DE3)中，用IPTG誘導表達得到含6×His標記的改良融合蛋白LL37.再以TALON柱芯親和層析、SDSPAGE和Westernblot鑒定后，用FXa裂解融合肽.將裂解后多肽進一步用強陽離子交換柱MacroPrepHighS純化、收集各洗脫峰,脫鹽、凍干.采用抑菌圈法檢測改良LL37的抗菌活性.結果：改良的LL37多肽于載體pET30a（+）在桿菌BL21star(DE3)中高效融合表達，用凝膠掃描顯示融合蛋白的表達量約占全菌蛋白的35％.融合蛋白經純化后用SDSPAGE鑒定在Mr4000處見單一條帶.經抑菌圈法檢測改良的LL37多肽對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都具有很好的殺菌力.結論：改良的人源性LL37多肽以原核細胞進行融合表達是可行的，并具有較強的殺菌活性.
【關鍵詞】人源殺菌肽LL37；蛋白質融合表達；殺菌活性
0引言
人類惟一的cathelicidingene所編碼的蛋白質為hCAP18(humanCationicantimicrobialprotein18),LL37是Cthelincidin蛋白hCAP18C端的37個氨基酸片段,為Mr4.5×103的陽離子兩性分子α螺旋抗菌肽，其氨基酸殘基序列為LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES［1-2］.LL37抗菌力較昆蟲細胞源性抗菌肽的殺菌力弱.最新分離出恒河猴的同源蛋白RL37與LL37同源性很高,其凈正電荷為+8,而LL37為+5.8，RL37的抗菌活性要高于LL37［3-4］.
根據SAR（structureactivityrelationship）研究顯示所有α螺旋抗菌肽的抗菌活性和抗菌普與肽鏈中所帶正電荷、疏水性氨基酸數目密切相關，通過分子改造增加LL37肽鏈中正電荷的氨基酸和堿性氨基酸數目，而不改變其α螺旋構象來提高其抗菌活性是一種較好的途徑［5-6］.本實驗室對LL37進行改良，將Glu16,Asp26,Glu36分別替換為Gln16，Asn26，Gln36，凈電荷由+5.8提高至+9.經PCR獲得編碼改良LL37的DNA全長基因片段，并且所設計的DNA序列中其引導序列含有凝血因子Xa酶切位點和帶負電荷的承載蛋白.我們通過構建適宜的表達載體、采用融合肽形式以大腸桿菌表達rLL37，將其克隆到含有6×His的特異親和純化標志序列的表達載體PET30a（+）中，從而在E.coli中表達出能被正確切割產生有抗菌活性的融合蛋白［7-8］.
1材料和方法
1.1材料BL21star菌、pET30a(+)，pMD18T和鼠抗6×HismAb購自ROCHE公司；DH5α菌由本研究所保存；ExTaq，SacⅠ，HindⅢ，Fxa裂解試劑盒購自TaKaRa公司；6×His親和純化TALON柱芯及強離子交換柱芯MacroPrepHighS分別購自Clontech公司和BioRad公司；改良殺菌肽LL37的DNA序列為本所構建.
1.2方法
1.2.1rLL37多肽融合表達質粒的構建將本所已構建的改良殺菌肽LL37的DNA序列經17g/L凝膠電泳、純化，以連接試劑盒（TAKARA）連接入pMD18T載體并轉入感受態DH5a菌中，鋪LB板（含Xgal0.04g/L，IPTG0.024g/L，Amp0.1g/L）進行藍白斑篩選，測序正確的單菌落進行擴增、抽質粒，并進行雙酶切（SacⅠ及HindⅢ）和凝膠電泳、純化.純化后的目的片段與同樣處理的載體pET30a+連接，轉入DH5a菌，鋪LB板（含Amp20mg/L）進行抗性篩選，將單菌落進行擴增后抽提質粒、PCR鑒定及測序鑒定.
1.2.2表達條件及產物的親和純化將鑒定正確的融合蛋白表達質粒PET30a(+)電轉化入工程表達菌BL21star(DE3)，挑取Kan抗性菌落，擴大培養于含30mg/LKan的LB培養基中,37℃振蕩培養至A600nm為0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為1mmol/L誘導表達8h，14000g離心5min收集菌體，超聲破碎細胞包涵體，21000g離心20min.離心后上清可溶性蛋白經TALON柱芯親合純化，沉淀包涵體蛋白經6mol/L的鹽酸胍溶解后經TALON柱芯親合純化，將可溶性蛋白及溶解后的包涵體分別以5mmol/L的咪唑洗滌雜蛋白，然后用150,300,500mmol/L的咪唑梯度洗脫目的蛋白，少量多次純化,收集主峰，脫鹽、冷凍干燥后得融合蛋白.
1.2.3SDSPAGE、染色按分子克隆第三版進行，用蛋白質銀染液染色.
1.2.4Westernblot分析以抗6×His單克隆抗體為一抗、HRP羊抗鼠IgG單抗為二抗，并以DAB顯色.
1.2.5溶合蛋白的FXa裂解參考文獻［7］的方法，將融合蛋白溶于FXa裂解緩沖液中，加入FXa，28℃保溫10h.
1.2.6rLL37多肽的離子交換純化、分子量測定將FXa裂解后的蛋白以強離子交換柱芯MacroPrepHighS進行梯度純化，條件為：平衡液10mmol/LNaCl,洗脫ABCD液分別為220，350，500及1000mmol/LNaCl，收集各洗脫峰，脫鹽、低溫低壓凍干.以Folin酚法測定蛋白質含量，并進行SDSPAGE初步鑒定rLL37的純度，依靠蛋白質在電泳中的移動距離與其分子量的對數成反比的關系，測定蛋白質Marker的各個條帶的距離，與其分子量的對數建立一元線性方程，通過測定rLL37的電泳移動距離，計算出rLL37的相對分子量（Mr）.
1.2.7用抑菌圈試驗測定rLL37多肽殺菌活性參照文獻［4-5］的方法,將15g/L的底層營養瓊脂培養基融化后取10mL倒入無菌平皿中，凝固后取7g/L的溫度為45℃的瓊脂培養基12mL，加入對數生長期的細菌旋渦振蕩［終濃度（3~4）×105］，快速覆蓋在底層膠上，凝固后在上層瓊脂上打孔，把一定濃度的rLL37多肽10μL滴入孔中,37℃孵育過夜.抑菌活力以抑菌圈直徑(mm)表示.同時取生理鹽水及Amp，左氧氟沙星等作對照.
2結果
2.1rLL37多肽融合表達質粒的構建改良殺菌肽LL37的DNA序列成功轉入表達載體pET30（a+）中（圖1）.抽質粒及PCR鑒定目的片段分子量大小正確（圖2），目的DNA序列經公司測序鑒定,證實rLL37基因正確地接入pET30a(+)質粒.
圖1構建rLL37多肽融合表達質粒流程圖（略）
2．2rLL37多肽的融合表達重組的表達質粒電轉化入工程表達菌BL21star(DE3)中，挑選抗Kan的陽性轉化子經IPTG誘導8h，經濃縮膠40g/L,分離膠150g/LSDSPAGE，蛋白質銀染染色，在蛋白質Mr約15×103處可見一條明顯條帶（圖3）.用凝膠掃描顯示重組融合蛋白的表達量約占全菌蛋白的35％.重組融合蛋白主要以包涵體蛋白形式存在，少量以可溶性蛋白形式存在.將可溶性蛋白和溶解后包涵體蛋白過6×His親和純化TALON柱心，經150mmol/L的咪唑洗下一個寬大的B峰，在300mmol/L的咪唑洗下一個較小的C峰.
圖2含目的片段質粒pET30a(+)的鑒定（略）
圖3rLL37在大腸桿菌中融合表達SDSPAGE分析（略）
2.3Westernblot將6×HisTALON親和純化收集的B，C峰蛋白脫鹽、凍干后進行免疫印跡鑒定，B峰在Mr約15×103處可見一條染淺棕色條帶，可證實B峰含有目的LL37片段（圖4）.
2．4rLL37多肽的離子交換純化將6×HisTALON親和純化收集的B峰用FXa裂解后，經MacroPrepHighS強陽離子柱純化，在350mmol/LNaCl洗脫峰經SDSPAGE，約在Mr約4000處可見單一的蛋白條帶（圖5），與rLL37多肽的理論Mr4013.8相符.共獲得約2.5mgrLL37，其制備率約為0.7mg/L.
2.5rLL37多肽的殺菌活性檢測用抑菌圈法證實rLL37肽抗生素對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都具有很好的抑菌力.測得rLL37對金黃色葡萄球菌(ATCC25923)的抑菌圈直徑18mm，Amp對金黃色葡萄球菌(ATCC25923)的抑菌圈直徑8mm，rLL37對金黃色葡萄球菌(ATCC25923)的抑菌作用明顯優于Amp；rLL37對糞腸球菌（ATCC29212）的抑菌作用（抑菌圈直徑13mm）也較左氧氟沙星（抑菌圈直徑10mm）好（圖6）.
圖4蛋白質免疫印記（略）
圖5FXa裂解、純化后重組rLL37的SDSPAGE分析（略）
3討論
臨床抗生素的廣泛大量使用，導致嚴重的致病菌耐藥性問題.殺菌肽（又稱抗菌肽、肽抗生素）為一類廣泛存在于許多生物中的內源性殺菌多肽.其作用特點在于既不容易導致耐藥菌株的產生，又具有廣譜抗微生物作用，因而具有極高的應用價值.在肽抗生素的開發研究中,顯然人體基因編碼的肽抗生素具有更大的優越性.人體基因編碼的肽抗生素為人體正常物質,他的殺菌機制不同于抗生素,產生抵抗性的可能性較小,而且他不含半胱氨酸合成較容易.目前國內外學者一方面研究人體內LL37多肽的分布范圍及其與感染的關系，如皮膚、氣管、腸道、鼻淚管等處的LL37含量與感染程度的關系，充分揭示了LL37對人體的保護作用，除了抗菌、拮抗內毒素作用外,通過激活細胞因子趨化免疫相關細胞等方式來增強機體獲得性免疫；另一方面運用氨基酸合成儀制備殺菌肽，并將肽鏈中的部分氨基酸殘基進行替換，以增強LL37多肽的殺菌力和拮抗內毒素的能力［5，9］.
圖6rLL37對金黃色葡萄球菌株殺菌實驗（略）
現在有許多載體用來在細菌中快速而有效地表達重組蛋白，我們采用含有6×His的特異親和純化標志序列的PET融合表達載體，將rLL37基因與6×His融合，并用蛋白質等電點分析軟件比較我們的rLL37基因融合表達載體與PET系列，如PET28a(+)，PET30a(+)等重組后的等電點，結果與PET30a(+)重組后的靜電荷最小，有利于親和純化.具有抗菌活性的肽抗生素在E.coli中直接表達時面臨兩個難題:一是肽抗生素對原核細胞(如細菌)具有抑殺作用,不易于用原核表達系統直接表達,其二,肽抗生素為小分子,表達產物不穩定,產量不高［8］.rLL37采用融合肽形式以大腸桿菌表達，在設計的引導序列中含有凝血因子Xa酶切位點，融合有引導序列的rLL37對大腸桿菌無害，細菌能正常生長和表達目的蛋白質，當以Fxa酶切除N端的引導序列，則rLL37的N端（帶正電荷）堿性多肽區暴露，恢復殺菌力；同時在rLL37多肽的N端加上一個負電荷的多肽，使得整個融合肽的電荷由pH7.4下的9.0降到3.0，利于TALON柱芯親和純化，進一步降低rLL37多肽對BL21star(DE3)表達菌的損害，提高rLL37多肽表達的產量，其中融合蛋白的表達量約占全菌蛋白的35％.從而使得rLL37以基因工程制備成為可能，為LL37多肽進一步深入研究奠定基礎.
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