Eca-109細胞生物學功能影響范文

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1方法

1.1干擾YAP1慢病毒轉染eca-109細胞將Eca-109細胞分為三組:轉染組(YAP1干擾慢病毒轉染Eca-109細胞)、空病毒轉染組(空病毒轉染Eca-109細胞)和空白對照組(未進行處理的Eca-109細胞)。在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)Eca-109細胞,待細胞狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期時,以每孔1×105細胞數(shù)接種于6孔板,培養(yǎng)液2mL,于37°C、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8h。棄去原培養(yǎng)液,加入1mL新鮮培養(yǎng)液,病毒稀釋后以MOI值40的病毒數(shù)量加入到6孔板中,混勻,繼續(xù)培養(yǎng)12h后棄去含病毒的培養(yǎng)液,加入1mL新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),常規(guī)換液,培養(yǎng)96h。熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況,轉染效率大于90%視為轉染成功,轉至培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2qPCR檢測各組細胞YAP1mRNA表達情況YAP1引物由上海生工生物工程有限公司構建,GAPDH為內參(表2)。取一定量的細胞用0.25%胰酶消化,離心收集細胞,加Trizol裂解提取總RNA,RNA濃度測定合格后,用逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA,以GAPDH為內參,進行qPCR。擴增程序為:95°C30s,95°C5s,60°C30s,40個循環(huán),每個樣品設置3個重復。

1.3Westernblot檢測YAP1和P53蛋白表達將轉染組、空病毒轉染組、空白對照組細胞進行消化離心后以預冷的PBS清洗細胞2次,轉至EP管離心棄上清液,加入適量蛋白裂解液和1%體積的蛋白酶抑制劑,置于冰上裂解30min,然后于4°C、12000r/min離心15min,得到總蛋白。BCA法測蛋白濃度,取50μg,10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉移至PVDF膜上,50g/L脫脂牛奶封閉2h后加入一定比例稀釋的一抗,4°C孵育過夜后TBST室溫搖床洗膜5min×5,加入相應稀釋的二抗,37°C孵育1h,TBST室溫搖床洗膜5min×5,加入ECL發(fā)光試劑后凝膠成像顯影。以β-actin為內參,對條帶用QuatityOne軟件進行統(tǒng)計分析。

1.4流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡培養(yǎng)細胞至鋪板70%~80%,換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,換正常培養(yǎng)液培養(yǎng)24h,消化、離心收集細胞,預冷PBS洗2次后加入預冷70%乙醇固定,4°C固定過夜。離心棄去固定液后加入RNase和PI,避光染色30min,流式細胞儀檢測周期分布。實驗重復3次。消化離心收集各組細胞約1×106,PBS洗2次加500μLBindingbuffer重懸細胞,加入2μLAnnexinV-FITC混勻,加入5μL碘化丙啶,混勻。避光、室溫反應5min,流式細胞儀檢測凋亡率。實驗重復3次。

1.5CCK8法檢測細胞增殖能力將對數(shù)生長期的Eca-109細胞按1000/孔的量接種于96孔板中,分三組(空白對照組、空病毒轉染組、轉染組),每組設3個復孔,每孔加100μL培養(yǎng)液,置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h。分別進行空病毒和慢病毒轉染操作,轉染24h后開始檢測,在固定時間向待測孔加入10μLCCK8溶液,37°C避光反應1h后用酶標儀測定吸光度(D)值。實驗重復3次。

1.6統(tǒng)計學分析采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(x_±s)表示,兩組均數(shù)比較采用t檢驗;多組間單因素分析采用One-WayANOVA檢驗;P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1慢病毒轉染獲得穩(wěn)定干擾YAP1的Eca-109細胞株轉染操作96h后于熒光顯微鏡下觀察熒光情況,空載體組和轉染組熒光均較強,經計算,轉染效率均在90%以上,轉入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),得到穩(wěn)定株(圖1)。

2.2qPCR檢測轉染前后YAP1mRNA的表達情況qPCR結果顯示,轉染組YAP1mRNA表達量明顯低于空白對照組和空病毒轉染組(P<0.05);而空白對照組和空病毒轉染組YAP1mRNA表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖2和表3)。

2.3Westernblot檢測各組細胞YAP1和P53蛋白的表達情況Westernblot結果顯示,轉染組YAP1的蛋白表達量低于空白對照組和空病毒轉染組(P<0.05);轉染組P53蛋白表達量高于空白對照組和空病毒轉染組(P<0.05);而空白對照組和空病毒轉染組YAP1以及P53蛋白表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,表3和圖3)。

2.4干擾YAP1基因對Eca-109細胞增殖的影響CCK8實驗結果顯示,在轉染前2d,轉染組、空病毒轉染組和空白對照組在每個時間點的D值無明顯差異(P>0.05);轉染后第4d開始,轉染組D值低于空白對照組和空病毒轉染組(P<0.05),而空病毒轉染組和空白對照組之間的D值仍無明顯差異(P>0.05,圖4)。

2.5干擾YAP1基因對Eca-109細胞凋亡的影響流式細胞儀對三組細胞進行檢測,結果顯示,轉染組早期凋亡率分別高于空白對照組和空病毒轉染組(P<0.05),差距有統(tǒng)計學意義,而空白對照組和空病毒轉染組早期凋亡率無明顯差異(P>0.05,圖5和表4)。

2.6干擾YAP1基因對Eca-109細胞細胞周期的影響流式細胞儀對三組細胞進行細胞周期檢測。結果顯示,轉染組G1期細胞比例高于空白對照組和空病毒轉染組(P<0.05),S期細胞比例低于空白對照組和空病毒轉染組(P<0.05),三組細胞間G2期細胞比例均無差異(P>0.05,圖6和表4)。

3討論

我國是食管癌高發(fā)區(qū),其發(fā)病率和病死率均居世界之首。HIPPO通路對哺乳動物細胞的增殖和凋亡有重要調節(jié)作用。YAP作為HIPPO通路中的重要元件,研究證明,YAP在多種腫瘤中高表達,如乳腺癌、肺癌和前列腺癌。目前認為,YAP為原癌基因,其磷酸化可促進細胞凋亡,其去磷酸化可促使其進入細胞核與核內TEAD結合,促進細胞增殖。然而,Aylon等[12]發(fā)現(xiàn),YAP可通過ASSP1影響p53基因,從而影響細胞凋亡。自1998年AndrewFire等首次發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象以來,RNA干擾成為研究基因的重要手段之一。近來,Xue等學者通過RNAi技術干擾食管癌Eca-109細胞HAT1(histoneacetyltrans-ferase1)基因,發(fā)現(xiàn)HAT1對于食管癌Eca-109細胞增殖具有重要作用。目前關于YAP在食管癌中的作用,國內外相關報道均較少。誘導腫瘤細胞凋亡一直是腫瘤治療的重要研究方向。本研究利用慢病毒轉染食管癌Eca-109細胞,使用qPCR和蛋白印跡法驗證YAP1基因的表達被成功抑制。后期本研究通過qPCR、蛋白印跡、CCK8實驗、流式細胞儀測周期和凋亡等多種方法驗證了干擾YAP1具有抑制Eca-109細胞增殖、促進其凋亡的作用。同時,通過轉染前后Eca-109細胞內p53基因的表達量分析,證實YAP1不僅僅作為HIPPO通路的重要組成元件,同時也可以通過p53基因途徑誘導細胞進入經典凋亡通路,促進食管癌Eca-109細胞凋亡。這些為食管癌的基因靶向治療奠定了一定的基礎。YAP1在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起著重要作用。雖然通過我們以上的研究證實了部分機制,然而關于YAP1與細胞凋亡發(fā)生的機制以及YAP1與其他通路之間的關系可能仍非常復雜,這有待于進一步研究。全面深入地研究YAP1的作用機制可能為食管癌的早期診斷和治療提供新的策略和靶點。

作者：宋杰 吳慶琛 張誠 王德林 單位：重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胸心外科 重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科