肝細(xì)胞生物學(xué)論文范文

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1材料與方法

1．1組織塊貼壁法分離培養(yǎng)hUC-MSCs臍帶取自正常分娩的新生兒(征得其父母同意)。首先用含雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗臍帶3次，去除雜物;用無(wú)菌的手術(shù)剪刀將臍帶剪成3～4cm的節(jié)段，再沿長(zhǎng)度方向剪開(kāi)，以暴露臍帶膠質(zhì)部分，去除血管;置于含雙抗的PBS中清洗3次，去除血污，再剪成約0．5cm3的組織塊，以膠質(zhì)部分貼于基底平鋪于24孔板中，每孔2～3塊，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育1～2h;待組織塊自然粘附于皿底部后加入含雙抗、FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3d更換一次培養(yǎng)基，待觀察到有小三角形或梭形細(xì)胞從組織中鋪展出時(shí)，取出組織塊。整個(gè)分離過(guò)程注意無(wú)菌操作。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%匯合時(shí)，即可傳代。利用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。取第5代細(xì)胞，采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)鑒定hUC-MSCs的表面標(biāo)記物CD44。

1．2肝細(xì)胞標(biāo)志基因的檢測(cè)按照總RNA提取試劑盒的操作說(shuō)明分別提取hUC-MSCs和人肝癌細(xì)胞HepG2的總RNA，用RNase-FreeDNaseⅠ去除基因組，最后檢測(cè)RNA的濃度和純度，立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA或保存于－80℃?zhèn)溆谩２捎肞rime-ScriptTMⅡHighFidelityRT-PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄2μgRNA得cDNA，取2μL用于PCR。根據(jù)GenBank提供的人肝細(xì)胞標(biāo)志基因序列，使用PrimerPremier5．0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列和產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。GAPDH為內(nèi)參對(duì)照。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物用20g/L的瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠分析系統(tǒng)下拍照。

1．3PAS糖原染色按照PAS染色試劑盒的說(shuō)明書操作，對(duì)第5代hUC-MSCs和HepG2進(jìn)行糖原染色，在倒置相差顯微鏡下觀察并照相。

2結(jié)果

2．1hUC-MSCs的分離、培養(yǎng)、傳代及鑒定組織塊貼壁培養(yǎng)3～4d時(shí)，可觀察到組織塊間隙鋪展出小三角形或長(zhǎng)梭形的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)至7d左右，可觀察到局部細(xì)胞呈集落生長(zhǎng)，此時(shí)，在無(wú)菌條件下取出組織塊，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1周左右，細(xì)胞可達(dá)80%～90%匯合，即可傳代。用胰酶/EDTA消化后細(xì)胞呈亮而圓的單個(gè)分散狀，以1∶3的比例進(jìn)行傳代，約4h貼壁，2d后迅速生長(zhǎng)。倒置相差顯微鏡下可觀察到細(xì)胞較大，輪廓清楚，內(nèi)部有清晰的應(yīng)力纖維，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核呈規(guī)則的卵圓形，核仁大而明顯，呈典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)(圖1A);持續(xù)培養(yǎng)大約2周時(shí)，細(xì)胞基本達(dá)到完全匯合，形態(tài)發(fā)生一定的變化，胞質(zhì)變得狹窄，內(nèi)部的應(yīng)力纖維也不明顯，呈平行排列或漩渦生長(zhǎng)(圖1B)。連續(xù)多次傳代，細(xì)胞保持穩(wěn)定的、相對(duì)均一的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)以及較強(qiáng)的增殖能力。經(jīng)鑒定分離培養(yǎng)的細(xì)胞CD44呈陽(yáng)性表達(dá)，且具有良好的均質(zhì)性。

2．2肝細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)以HepG2作為陽(yáng)性對(duì)照，用RT-PCR檢測(cè)hUC-MSCs的肝細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)圖2，hUC-MSCs表達(dá)ALB、CK18、G6P、GLUL和MET，不表達(dá)TAT。

2．3PAS糖原染色結(jié)果對(duì)hUC-MSCs和HepG2進(jìn)行PAS糖原染色，染色結(jié)果顯示兩種細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中均有紫色顆粒物形成，即均呈糖原陽(yáng)性反應(yīng)(圖3)。

3討論

MSCs能分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，具有直接或間接的抗炎及抗纖維化作用，可抑制肝細(xì)胞的死亡和纖維化;還可通過(guò)其分泌物抑制肝細(xì)胞的凋亡、刺激肝細(xì)胞再生、為受損肝細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)支持等。MSCs還具有低免疫原性及免疫抑制力，適用于進(jìn)行同種異體移植，在移植后可遷移、歸巢至受損的組織，發(fā)揮治療作用。因此，MSCs在肝臟疾病的細(xì)胞移植治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。研究發(fā)現(xiàn)，相較不同來(lái)源的MSCs，臍帶來(lái)源的MSCs不僅具有干細(xì)胞的特性，而且來(lái)源豐富、取材方便、增殖能力較強(qiáng)、無(wú)倫理法律限制，還具有較低的免疫原性和分化程度，從而成為一個(gè)非常有吸引力的移植治療肝病的細(xì)胞來(lái)源。

作者采用組織塊貼壁培養(yǎng)法從臍帶基質(zhì)中分離獲得hUC-MSCs，與酶消化法和流式細(xì)胞儀或免疫磁珠分選法相比，該分離方法操作簡(jiǎn)單，消耗低，易于控制。分離培養(yǎng)的hUC-MSCs呈典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，具有MSCs的表型特征，均質(zhì)性良好，且在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)中能保持穩(wěn)定狀態(tài)。進(jìn)一步的RT-PCR結(jié)果顯示，培養(yǎng)的hUC-MSCs同時(shí)表達(dá)成熟肝細(xì)胞的標(biāo)志基因ALB、CK18、G6P、GLUL和MET，而不表達(dá)TAT，與Campard等的研究結(jié)果一致，提示hUC-MSCs可能具有肝細(xì)胞的一些相關(guān)功能，如合成白蛋白、合成糖原及解毒功能等;PAS糖原染色結(jié)果則證明hUC-MSCs具有糖原合成和儲(chǔ)存能力。

但上述結(jié)果并不能證明hUC-MSCs為成熟的肝細(xì)胞，在其他組織如卵巢、胰臟內(nèi)也可發(fā)現(xiàn)ALB、角蛋白的表達(dá)。綜上所述，組織塊貼壁培養(yǎng)法可有效獲得穩(wěn)定、均質(zhì)性良好的hUC-MSCs，其本身同時(shí)表達(dá)多種成熟肝細(xì)胞的標(biāo)志基因并具有一定的肝細(xì)胞功能，可能更適宜于作為誘導(dǎo)性肝細(xì)胞的起始細(xì)胞或直接代替肝細(xì)胞用于移植治療相關(guān)的肝臟疾病，從而滿足基礎(chǔ)研究與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域尤其臨床應(yīng)用對(duì)肝細(xì)胞的需求。

作者：李麗麗王巧燕代克強(qiáng)丁一樊晉宇單位：河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院