肝細胞生物學論文范文

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1材料與方法

1．1組織塊貼壁法分離培養hUC-MSCs臍帶取自正常分娩的新生兒(征得其父母同意)。首先用含雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗臍帶3次，去除雜物;用無菌的手術剪刀將臍帶剪成3～4cm的節段，再沿長度方向剪開，以暴露臍帶膠質部分，去除血管;置于含雙抗的PBS中清洗3次，去除血污，再剪成約0．5cm3的組織塊，以膠質部分貼于基底平鋪于24孔板中，每孔2～3塊，置于37℃、體積分數5%CO2培養箱孵育1～2h;待組織塊自然粘附于皿底部后加入含雙抗、FBS的低糖DMEM培養基，繼續置于培養箱內培養，每3d更換一次培養基，待觀察到有小三角形或梭形細胞從組織中鋪展出時，取出組織塊。整個分離過程注意無菌操作。待細胞生長至70%～80%匯合時，即可傳代。利用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態。取第5代細胞，采用細胞免疫熒光技術鑒定hUC-MSCs的表面標記物CD44。

1．2肝細胞標志基因的檢測按照總RNA提取試劑盒的操作說明分別提取hUC-MSCs和人肝癌細胞HepG2的總RNA，用RNase-FreeDNaseⅠ去除基因組，最后檢測RNA的濃度和純度，立即進行反轉錄合成cDNA或保存于－80℃備用。采用Prime-ScriptTMⅡHighFidelityRT-PCR試劑盒反轉錄2μgRNA得cDNA，取2μL用于PCR。根據GenBank提供的人肝細胞標志基因序列，使用PrimerPremier5．0軟件設計引物，引物序列和產物大小見表1。GAPDH為內參對照。PCR反應條件:94℃預變性5min;94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸30s，30個循環;最后72℃延伸5min。PCR產物用20g/L的瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠分析系統下拍照。

1．3PAS糖原染色按照PAS染色試劑盒的說明書操作，對第5代hUC-MSCs和HepG2進行糖原染色，在倒置相差顯微鏡下觀察并照相。

2結果

2．1hUC-MSCs的分離、培養、傳代及鑒定組織塊貼壁培養3～4d時，可觀察到組織塊間隙鋪展出小三角形或長梭形的細胞，繼續培養至7d左右，可觀察到局部細胞呈集落生長，此時，在無菌條件下取出組織塊，更換新鮮培養基，繼續培養1周左右，細胞可達80%～90%匯合，即可傳代。用胰酶/EDTA消化后細胞呈亮而圓的單個分散狀，以1∶3的比例進行傳代，約4h貼壁，2d后迅速生長。倒置相差顯微鏡下可觀察到細胞較大，輪廓清楚，內部有清晰的應力纖維，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結構，細胞核呈規則的卵圓形，核仁大而明顯，呈典型的成纖維細胞樣形態(圖1A);持續培養大約2周時，細胞基本達到完全匯合，形態發生一定的變化，胞質變得狹窄，內部的應力纖維也不明顯，呈平行排列或漩渦生長(圖1B)。連續多次傳代，細胞保持穩定的、相對均一的成纖維細胞樣形態以及較強的增殖能力。經鑒定分離培養的細胞CD44呈陽性表達，且具有良好的均質性。

2．2肝細胞標志基因的表達以HepG2作為陽性對照，用RT-PCR檢測hUC-MSCs的肝細胞標志基因的表達情況，結果見圖2，hUC-MSCs表達ALB、CK18、G6P、GLUL和MET，不表達TAT。

2．3PAS糖原染色結果對hUC-MSCs和HepG2進行PAS糖原染色，染色結果顯示兩種細胞的細胞質中均有紫色顆粒物形成，即均呈糖原陽性反應(圖3)。

3討論

MSCs能分泌多種細胞因子和生長因子，具有直接或間接的抗炎及抗纖維化作用，可抑制肝細胞的死亡和纖維化;還可通過其分泌物抑制肝細胞的凋亡、刺激肝細胞再生、為受損肝細胞提供營養支持等。MSCs還具有低免疫原性及免疫抑制力，適用于進行同種異體移植，在移植后可遷移、歸巢至受損的組織，發揮治療作用。因此，MSCs在肝臟疾病的細胞移植治療中具有廣闊的應用前景。研究發現，相較不同來源的MSCs，臍帶來源的MSCs不僅具有干細胞的特性，而且來源豐富、取材方便、增殖能力較強、無倫理法律限制，還具有較低的免疫原性和分化程度，從而成為一個非常有吸引力的移植治療肝病的細胞來源。

作者采用組織塊貼壁培養法從臍帶基質中分離獲得hUC-MSCs，與酶消化法和流式細胞儀或免疫磁珠分選法相比，該分離方法操作簡單，消耗低，易于控制。分離培養的hUC-MSCs呈典型的成纖維細胞樣形態，具有MSCs的表型特征，均質性良好，且在體外長期培養中能保持穩定狀態。進一步的RT-PCR結果顯示，培養的hUC-MSCs同時表達成熟肝細胞的標志基因ALB、CK18、G6P、GLUL和MET，而不表達TAT，與Campard等的研究結果一致，提示hUC-MSCs可能具有肝細胞的一些相關功能，如合成白蛋白、合成糖原及解毒功能等;PAS糖原染色結果則證明hUC-MSCs具有糖原合成和儲存能力。

但上述結果并不能證明hUC-MSCs為成熟的肝細胞，在其他組織如卵巢、胰臟內也可發現ALB、角蛋白的表達。綜上所述，組織塊貼壁培養法可有效獲得穩定、均質性良好的hUC-MSCs，其本身同時表達多種成熟肝細胞的標志基因并具有一定的肝細胞功能，可能更適宜于作為誘導性肝細胞的起始細胞或直接代替肝細胞用于移植治療相關的肝臟疾病，從而滿足基礎研究與再生醫學領域尤其臨床應用對肝細胞的需求。

作者：李麗麗王巧燕代克強丁一樊晉宇單位：河南師范大學生命科學學院