扇頭蜱分子生物學(xué)論文范文

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1材料與方法

1.1采集地點(diǎn)的選擇伊寧縣位于東經(jīng)80°13′～82°42′，北緯43°35′～44°29′之間，東鄰尼勒克縣，西與伊寧市和霍城縣接壤，南鄰伊犁河，與察布查爾、鞏留兩縣隔河相望。同時(shí)，位于伊犁河谷中部，水草豐富，境內(nèi)的伊寧口岸是伊犁地區(qū)重要的貿(mào)易口岸。

1.2實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1蜱的來源2013年4－5月，從伊寧縣的2個(gè)采集點(diǎn)、2個(gè)綿羊群，每群＞30只，均未藥浴，采集其體表寄生蜱，共獲得硬蜱324只，放置于潮濕陰暗處，以保持其存活。

1.2.2主要試劑PCR所用試劑均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；DNA提取試劑盒（DNeasyBloodTissueKit）購自德國Qiagen公司；其他試劑均為分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1蜱種鑒定參照《中國經(jīng)濟(jì)昆蟲志》［9］，用普通解剖顯微鏡將324只蜱進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，初步分類后，從中選取50只用配備數(shù)碼照相功能的解剖顯微鏡（LEICAM165C）拍攝圖片，對蜱的盾板、假頭、假頭基、肛側(cè)板、氣門板、第一緣垛、孔區(qū)（雌蜱）等形態(tài)進(jìn)行對比觀察并測量［11］。1.3.2蜱的處理和DNA提取將蜱標(biāo)本分別依次用濃度為70%、50%、30%、10%的乙醇溶液于37℃搖床中振蕩沖洗1h，再用超純水反復(fù)沖洗，干燥。最后置于消毒滅菌的1.5mlEP管中。按照DNA提取試劑盒使用說明書提取蟲體基因組DNA，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3基因擴(kuò)增用上游引物5′-CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCTGTGG-3′，下游引物5′-CCGGTCTGAACTCAGATCAAGT-3′擴(kuò)增線粒體16SrRNA序列［12］；上游引物5′-CAAAAWCCTGGTAAAATTAAA-3′和下游引物5′-GCACTATCAAGCAACACGACT-3′擴(kuò)增COⅠ序列［10］。25μlPCR反應(yīng)體系：模板1.5μl（約50ng），上游和下游引物各0.75μl（75pmol），50mmol/LKCl，10mmol/LTris⁃HCl（pH8.3），1.5mmol/LMgCl2，1單位TaqDNA聚合酶。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：①16SrRNA為94℃預(yù)變性5min，92℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共38個(gè)循環(huán)，72℃終延伸8min。②COⅠ為94℃預(yù)變性5min，92℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸60s，共38個(gè)循環(huán)，72℃終延伸8min。擴(kuò)增片段后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。1.3.4序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)合GenBank登錄的圖蘭扇頭蜱的16SrRNA和COⅠ參考序列，將本實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增的6條16SrRNA及6條COⅠ序列測序結(jié)果與參考序列比對，運(yùn)用Mega5.0軟件的ClustalX程序分析，計(jì)算遺傳距離并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

2結(jié)果

2.1蜱種鑒定所鑒定蜱共324只（168♂、156♀），蟲體體型較小，雌蟲體長3.2～5.5mm，雄蟲體長2.9～3.6mm，呈褐色，背腹扁平似卵圓形，芝麻至米粒大，雌蜱飽血后可膨脹達(dá)蓖麻籽大。體分為假頭和軀體兩個(gè)主要部分（圖1A）。假頭基呈六角形，側(cè)角明顯，后緣微凹（圖1B）。雄蜱盾板覆蓋整個(gè)背部，雌蜱盾板覆蓋背前部，前部較窄，后部圓鈍，盾板遍布刻點(diǎn)，以細(xì)刻點(diǎn)居多，粗刻點(diǎn)少而零散（圖1C）。眼卵圓，靠近盾板前部邊緣。須肢粗短，中部最寬，前端稍窄。雄蜱氣門板長卵形（圖1D）。體端有緣垛，中垛大于邊垛，常有尾突（圖1E）。有肛溝，雄性肛側(cè)板后緣內(nèi)斜明顯，內(nèi)緣具角突，長約為寬的2.5～3.0倍，內(nèi)緣中部稍凹，后緣向內(nèi)顯著傾斜，其后方凸角明顯（圖1F）。結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)［9，13］認(rèn)為伊寧縣的蜱具有硬蜱科扇頭蜱屬圖蘭扇頭蜱的特征。但由于吸血、飽血雌蜱及部分未成熟或形態(tài)變異的雄蜱，僅用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類方法不能準(zhǔn)確區(qū)分。因此，從324只中選出6只雌雄分別具有形態(tài)差異的蜱（4♂、2♀），根據(jù)采集地點(diǎn)分別將其命名為YN-1、YN-2、YN-3、YN-4、YN-5和YN-6。YN-1為當(dāng)?shù)氐湫托坌詧D蘭扇頭蜱；YN-2和YN-3為半飽血雌蜱，因其腹部吸血膨脹已無法觀察緣垛，肛側(cè)板和副肛側(cè)板難以區(qū)分形態(tài)且邊界不清；YN-4、YN-5和YN-6為部分形態(tài)特征改變雄蜱，YN4和YN5體端較寬似倒置三角形與典型的圖蘭扇頭蜱卵圓形體端不同，且YN5氣門板呈長逗點(diǎn)形與血紅扇頭蜱氣門板相似；YN6肛側(cè)板后緣圓鈍，凸角不明顯。因此對這6只蜱采用分子生物學(xué)方法進(jìn)一步分析，對上述形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.2分子生物學(xué)鑒定

2.2.1PCR擴(kuò)增通過PCR擴(kuò)增上述形態(tài)學(xué)差異較大的6只圖蘭扇頭蜱線粒體DNA，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，均獲得特異性很好的PCR產(chǎn)物，與預(yù)期目的片段一致（16SrRNA約為460bp，COⅠ約為760bp）。

2.2.2圖蘭扇頭蜱16SrRNA和COⅠ基因片段組成利用Mega5.0軟件計(jì)算6只圖蘭扇頭蜱的16SrRNA和COⅠ基因片段堿基組成。16SrRNA基因片段A、T、C、G的平均堿基含量分別為36.68%、37.12%、10.7%和15.5%，堿基A＋T平均含量是73.78%。COⅠ基因片段A、T、C、G的平均堿基含量分別為38.56%、31.78%、14.12%和15.54%，堿基A＋T平均含量是70.34%。

2.2.3圖蘭扇頭蜱基因序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹運(yùn)用Mega5.0軟件的ClustalX程序進(jìn)行多重序列比對后，16SrRNA獲得2種不同序列，并登錄GenBank，登錄號分別為KF547987和KF547989；COⅠ獲得3種不同序列，登錄號分別為KF688136、KF688137和KF688138。各結(jié)合GenBank登錄的3種扇頭蜱的參考序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。6只圖蘭扇頭蜱16SrRNA基因片段的遺傳變異很小，共檢測出2個(gè)單倍型，1個(gè)變異位點(diǎn)。其中YN-2、YN-3、YN-4和YN-5序列相同，為一種單倍型；YN-1、YN-6在216位點(diǎn)處為轉(zhuǎn)換位點(diǎn)（T-C），為一種單倍型。基因序列比較結(jié)果顯示同源性均在99.5%以上，遺傳距離為0.3%～0.5%。而上述6只圖蘭扇頭蜱的COⅠ基因片段序列變異較大，共檢測出3個(gè)單倍型，4個(gè)變異位點(diǎn)。YN-1、YN-2和YN-6序列相同，為一種單倍型；YN-3和YN-5檢測到3個(gè)變異位點(diǎn)，均為轉(zhuǎn)換位點(diǎn)（A-G），無插入/缺失和顛換現(xiàn)象；YN-4在上述變異基礎(chǔ)上，于574位點(diǎn)處發(fā)生轉(zhuǎn)換（A-G）。基因序列比較結(jié)果顯示同源性均在98.6%以上，遺傳距離為0.3%～1.9%。

3討論

調(diào)查結(jié)果表明新疆伊寧縣綿羊體表普遍寄生了圖蘭扇頭蜱，據(jù)以往報(bào)道圖蘭扇頭蜱主要分布于新疆的巴楚、喀什、霍城、和田、哈密、呼圖壁、庫爾勒、輪臺、阿瓦提、沙雅、于田等荒漠草原和荒漠地區(qū)［14］。而伊寧縣地處亞歐大陸腹地，伊犁河谷中部，屬中溫帶干旱型內(nèi)陸山地氣候，該地區(qū)氣候溫和，水源充沛，水草豐茂，以往并不適合圖蘭扇頭蜱的生存繁殖，而此次在伊寧縣發(fā)現(xiàn)圖蘭扇頭蜱分布普遍，可能與新疆北疆近30年雨水過少、特殊的植被分布及氣候改變有關(guān)。線粒體基因已成為群體遺傳學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)研究中的重要分子標(biāo)記。Murrell等［15］認(rèn)為線粒體基因?qū)τ诜肿舆M(jìn)化的研究具有很大價(jià)值，且更適于種內(nèi)遺傳差異的分析。目前蜱類研究中用的最多的線粒體基因?yàn)?2SrRNA、16SrRNA、COⅠ和COⅡ等基因［10］。線粒體上的不同基因具有不同的解析功能，同一基因在不同的物種間也具有不同的解析能力。并且，在系統(tǒng)發(fā)育研究中多個(gè)數(shù)據(jù)比單個(gè)數(shù)據(jù)的效果要好，16SrRNA基因序列由于其保守性和存在的普遍性，被大量用于蜱類的物種鑒定和系統(tǒng)研究［12，16-17］。COⅠ基因是線粒體呼吸鏈末端的一個(gè)催化酶，比其他基因在生化功能的研究上更完備，普遍存在于真核生物和原核物細(xì)胞的線粒體中；此外，COⅠ基因是核基因組以外獨(dú)立的線粒體環(huán)狀DNA，所以能夠用來比較其在生物進(jìn)化上的相互關(guān)系［18］。呂繼洲等［19］通過16SrRNA和COⅠ基因鑒定小亞璃眼蜱（H.anatolicum）、亞洲璃眼蜱（H.asiaticum）和殘緣璃眼蜱（H.detritum）3種形態(tài)上極其相近的蜱種。一般來說，在變異程度上16SrRNA基因較COⅠ基因明顯保守［20］，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。并且，通過對2個(gè)基因的研究發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)圖蘭扇頭蜱種內(nèi)遺傳差異顯著，證實(shí)圖蘭扇頭蜱具有生物多樣性。由于蜱傳播病原體一般與蜱種之間存在著一定的對應(yīng)關(guān)系，親緣關(guān)系越近的蜱種，其傳播相同病原體的機(jī)會越大［21］。因此，不同蜱種的種內(nèi)遺傳差異與蜱傳疾病的變化仍需進(jìn)一步研究，為蜱媒病的預(yù)防控制提供依據(jù)。

作者：杜景云牟路萌張璘王麗娜王安東張科陳創(chuàng)夫王遠(yuǎn)志單位：新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院山東省濟(jì)南市中心醫(yī)院新疆石河子大學(xué)動物科技學(xué)院河南省平頂山學(xué)院新農(nóng)村發(fā)展研究院