凍融胚胎移植技術(shù)應(yīng)用范文

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作者：王曉紅，羅亞寧，李麗，楊艷紅，閆凱麟，黃劍磊，閔保華

【關(guān)鍵詞】凍融

【摘要】目的：研究凍融胚胎移植的臨床應(yīng)用及分析影響凍融胚胎移植妊娠率的相關(guān)因素.方法：對(duì)63例80個(gè)凍融胚胎移植周期進(jìn)行回顧性分析，通過IVF或ICSI獲得的剩余胚胎采用慢速法冷凍保存，快速法解凍復(fù)蘇.結(jié)果：解凍392個(gè)胚胎，成活269個(gè)胚胎，胚胎復(fù)蘇率為68.62%.周期臨床妊娠率為23.75%.每周期植入3個(gè)胚胎組的臨床妊娠率顯著高于植入≤2個(gè)胚胎組（χ2=4.98,P<0.05）.妊娠周期胚胎細(xì)胞完整率及優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著高于非妊娠周期（67.28%vs60.09%,89.09%vs73.55%，均為P<0.025）.結(jié)論：凍融胚胎移植的成功率與移植胚胎的數(shù)量和質(zhì)量密切相關(guān).

【關(guān)鍵詞】凍融；冷凍胚胎；胚胎移植；妊娠率

0引言

胚胎冷凍技術(shù)是將胚胎放入冷凍保護(hù)劑中，在超低溫環(huán)境中保存，需要時(shí)再將胚胎解凍復(fù)蘇的技術(shù)，它是“試管嬰兒”即體外受精―胚胎移植（invitrofertilizationandembryotransfer,IVFET）技術(shù)的一項(xiàng)重要衍生技術(shù).在本生殖醫(yī)學(xué)中心200309/200412間共接受IVF或單精子卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顯微注射（intracytoplasmicsperminjection,ICSI）技術(shù)助孕治療的不孕癥患者63例，80個(gè)凍融胚胎移植治療周期，80個(gè)凍融胚胎移植治療周期中來自IVF71個(gè)周期，ICSI9個(gè)周期，報(bào)道如下.

1材料和方法

1.1材料

冷凍胚胎來源：促超排卵、取卵、體外受精及胚胎培養(yǎng)，均按本中心操作常規(guī)進(jìn)行，于取卵術(shù)后48~72h將2~3個(gè)新鮮胚胎移植入子宮腔.剩余的存活胚胎（Fig1A），采用慢速法冷凍保存，快速法解凍復(fù)蘇［1］.

1.2方法

1.2.1胚胎冷凍冷凍液CryoPBS：含25g/L人血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液（PBS+25g/LHAS）；FS1:1.5mol/L丙二醇+CryoPBS;FS2:1.5mol/L丙二醇+0.1mol/L蔗糖+CryoPBS.冷凍液及解凍液均來自瑞典Vitrolife公司.在四孔培養(yǎng)皿1,2,3,4號(hào)孔中分別加入1mLCryoPBS,FS1,FS2,FS2，室溫平衡.將胚胎放入CryoPBS2~5min后，放入FS1保持10min，再將胚胎放入FS2后裝入麥管并封口.將麥管放入冷凍儀（PlanerKryo3601.7，英國）開始冷凍程序：從18℃起，以2℃/min逐漸降溫至-7℃，此時(shí)用液氮浸透的棉簽在麥管接近棉塞的部位進(jìn)行植冰（seeding），然后以0.3℃/min緩慢降溫到-30℃,再快速降溫至-100℃程序結(jié)束，迅速取出麥管，放入液氮罐（-196℃）保存.

1.2.2胚胎解凍解凍液TS1:1.0mol/L丙二醇+0.2mol/L蔗糖+CryoPBS;TS2:0.5mol/L丙二醇+0.2mol/L蔗糖+CryoPBS;TS3:0.2mol/L蔗糖+CryoPBS.將解凍液TS1,TS2,TS3及CryoPBS分別按順序加入四孔培養(yǎng)皿中，從液氮罐中拿出麥管，室溫下解凍30s后，放進(jìn)30℃水浴中30s.剪去一端或拔掉塞子，接上麥管操作器，然后再剪去另一端，小心地將胚胎吹入TS1中，在TS1中孵育5min，移入TS25min，再移入TS3中5~10min，將胚胎放進(jìn)CryoPBS，37℃下保持10min.最后將胚胎放入培養(yǎng)液中培養(yǎng)2~12h，檢查胚胎存活率并記錄胚胎形態(tài)，有半數(shù)以上的分裂球存活的胚胎可以移植（Fig1B）.

1.2.3凍融胚胎移植（FET）時(shí)機(jī)選擇①自然周期（naturalcycles）：規(guī)律月經(jīng)有排卵的患者一般選擇在自然周期進(jìn)行FET.在預(yù)計(jì)排卵日前3~4d行黃體生成素（LH）測定，同時(shí)B超監(jiān)測卵泡發(fā)育和排卵，排卵后2~3d或LH峰出現(xiàn)4d后行FET.②激素替代周期（hormonereplacetreatment）：雌激素水平低下的無排卵的患者在激素替代周期內(nèi)進(jìn)行FET.從月經(jīng)周期或撤退性出血的第2~3日起，戊酸雌二醇2~8mg/d,po,10~14d后B超監(jiān)測子宮內(nèi)膜厚度，當(dāng)子宮內(nèi)膜厚度≥8mm時(shí)，開始加用黃體酮60~100mg/d，給予黃體酮4d后，解凍胚胎并FET.③促排卵周期（ovarystimulationcycles）：月經(jīng)稀發(fā)或月經(jīng)不規(guī)律的患者，可給予克羅米芬（CC）或人絕經(jīng)尿促性腺激素（HMG）促排卵治療，陰道B超監(jiān)測卵泡發(fā)育，當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑≥18mm時(shí)給予hCG5~10kU,im.排卵后2~3d或注射HCG后84h行FET.

1.2.4妊娠監(jiān)測于移植后15d查尿或血HCG，若陽性則于停經(jīng)7wk行B超檢查，見孕囊及原始心管搏動(dòng)診斷為臨床妊娠，繼續(xù)隨訪至妊娠結(jié)束.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：年齡、不孕時(shí)間、移植胚胎數(shù)等定量資料以x±s表示；對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)；用SPSS12.0軟件進(jìn)行多因素Logistic回歸分析.

2結(jié)果

2.1一般概況與結(jié)局80個(gè)FET治療周期，年齡23~36(31.4±3.0)歲，不孕時(shí)間1~15(6.3±3.1)a.解凍胚胎392個(gè)，復(fù)蘇胚胎269個(gè)，胚胎復(fù)蘇率為68.62%.每周期移植胚胎數(shù)1~3(2.6±0.6)個(gè).19例臨床妊娠，臨床妊娠率23.75%（19/80）；流產(chǎn)4例，流產(chǎn)率21.05%（4/19）；多胎5例（均為雙胎），多胎率26.32%（5/19）.已分娩6例，出生嬰兒8（男5，女3）名，體質(zhì)量(2523.8±497.7)g，隨訪至200412均發(fā)育正常，身體健康.9例繼續(xù)妊娠中.

2.2年齡與臨床妊娠率的關(guān)系將病歷資料劃分為2個(gè)年齡段，比較臨床妊娠率，兩組間無顯著性差異（χ2=0.84,P>0.05），<30歲組19個(gè)周期，臨床妊娠6例，臨床妊娠率31.58%；30~36歲組61個(gè)周期，臨床妊娠13例，周期臨床妊娠率21.31%.

2.3不同體外受精方式及不同移植周期類型與臨床妊娠率的關(guān)系將病歷資料按不同的體外受精方式劃分為IVF組和ICSI組，比較臨床妊娠率，兩組間無顯著性差異（χ2=0.01,P>0.05），IVF組71個(gè)周期，臨床妊娠17例，周期臨床妊娠率23.94%；ICSI組9個(gè)周期，臨床妊娠2例，周期臨床妊娠率22.22%.不同類型周期的臨床妊娠率三組間無顯著性差異（χ2=0.16,P>0.05,Tab1）.

2.4移植胚胎數(shù)目與臨床妊娠率的關(guān)系每周期植入3個(gè)胚胎組55個(gè)周期，臨床妊娠17例，周期臨床妊娠率30.91%；每周期植入≤2個(gè)胚胎組25個(gè)周期，臨床妊娠2例，周期臨床妊娠率8%.每周期植入3個(gè)胚胎組的臨床妊娠率顯著高于植入≤2個(gè)胚胎組（χ2=4.98,P<0.05）.表1不同類型移植周期的臨床結(jié)局（略）

2.5影響FET結(jié)局的多因素Logistic回歸分析將可能影響FET結(jié)局的因素：年齡、不孕時(shí)間、受精方式、移植周期類型、移植胚胎數(shù)目，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析.結(jié)果顯示：移植胚胎數(shù)目對(duì)FET結(jié)局有很大影響，多移植1個(gè)凍融胚胎，可使妊娠成功的機(jī)率增加約7倍（P=0.017,OR=6.953）；不孕時(shí)間對(duì)FET結(jié)局也有影響，不孕時(shí)間每增加1a，妊娠成功的機(jī)率減少約30%（P=0.010,OR=0.722）.

2.6妊娠周期與非妊娠周期的比較妊娠周期胚胎復(fù)蘇率（復(fù)蘇胚胎個(gè)數(shù)/解凍胚胎個(gè)數(shù)×100%）與非妊娠周期無顯著性差異（χ2=3.19,P>0.05）；妊娠周期細(xì)胞完整率（復(fù)蘇后胚胎細(xì)胞總數(shù)/冷凍時(shí)胚胎細(xì)胞總數(shù)×100%）顯著高于非妊娠周期（χ2=6.21,P<0.025）；妊娠周期優(yōu)質(zhì)胚胎率（Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)胚胎總個(gè)數(shù)/移植胚胎總個(gè)數(shù)×100%）顯著高于非妊娠周期（χ2=5.65,P<0.025,Tab2）.表2妊娠周期與非妊娠周期的比較（略）

3討論

本研究中凍融胚胎移植的周期臨床妊娠率為23.75%，與Karltrom等［2］和Oehninger等［3］22%~25%的研究結(jié)果相似.有研究顯示與常規(guī)IVF技術(shù)的凍融胚胎移植相比，ICSI治療后的凍融胚胎移臨床妊娠率顯著下降，但也有報(bào)道認(rèn)為兩者無顯著性差異［4］.本結(jié)果顯示ICSI技術(shù)并未影響凍融胚胎的種植潛能.由于本研究ICSI例數(shù)較少，尚需更大樣本的研究加以證實(shí).

關(guān)于凍融胚胎移植時(shí)機(jī)的選擇目前的研究尚無一致的結(jié)論.本結(jié)果顯示采用不同類型周期移植凍融胚胎，其成功率無明顯差異.我們認(rèn)為，針對(duì)不同的患者，采用不同的方案，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化，盡量使子宮內(nèi)膜與胚胎發(fā)育同步，提高子宮內(nèi)膜的容受性，以獲得較高的妊娠率.鑒于自然周期符合生理、簡便、經(jīng)濟(jì)，我們認(rèn)為有排卵者盡量采用自然周期為宜.

多數(shù)研究認(rèn)同在凍融胚胎移植的治療中，年齡是影響妊娠率的重要因素，尤其是35歲以上，生育力明顯下降.其原因主要是卵巢功能減退，卵子質(zhì)量及子宮內(nèi)膜的容受性下降以及遺傳異常影響受精和妊娠的維持.本研究顯示：<30歲組和30~36歲組，周期臨床妊娠率雖未證實(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但仍能顯示出妊娠率隨年齡增高而下降的趨勢(shì)；妊娠結(jié)局與不孕時(shí)間有顯著的負(fù)相關(guān)性，隨不孕時(shí)間延長，患者年齡增加，妊娠率降低，所以不孕癥患者及早治療是非常重要的.

凍融胚胎移植的妊娠率與移植胚胎的數(shù)量［5］和質(zhì)量［6］密切相關(guān).本結(jié)果顯示，每周期植入3個(gè)胚胎組的臨床妊娠率明顯高于移植≤2個(gè)胚胎組.多因素回歸分析研究也顯示，妊娠結(jié)局與移植胚胎數(shù)目有顯著的正相關(guān)性.此外，妊娠周期的細(xì)胞完整率及優(yōu)質(zhì)胚胎率均高于非妊娠周期，提示凍融胚胎的質(zhì)量可能會(huì)影響妊娠率.我們推測細(xì)胞完整率更為直接地反映了胚胎對(duì)解凍過程的耐受情況，可成為預(yù)測妊娠結(jié)局的一個(gè)指標(biāo).