表觀繼承毒物學安全指數評估范文

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作者：殷宏金涌邢仕歌田世民單位：中國檢科院綜合檢測中心毒理實驗室北京

自從1957年Waddington提出表觀遺傳學的概念后，表觀遺傳學和表觀基因組學有了相當大的發(fā)展。表觀基因組學是在全基因組水平上研究表觀遺傳學標志及其與基因表達的相互關系。這一新興領域已對毒理學研究與實踐產生重大的影響。國內，表觀遺傳學在毒理學研究已較深入地開展了一些研究，并發(fā)表了綜述。

1外源化學物的表觀遺傳毒性

基因表達的表觀遺傳調控是通過DNA甲基化，組蛋白編碼和相關的非編碼RNA(如miRNA)來完成的。3種機制各自的貢獻取決于特定基因及其環(huán)境，如物種，細胞類型，機體的發(fā)育階段和年齡，此外，每個因素可能受到其他因素的影響。因此，表觀基因組的調控是一個強大的和動態(tài)的綜合過程，在發(fā)育和維持分化狀態(tài)中起關鍵作用。雖然表觀基因組不是所有的改變預期都是有害的，但有些可能產生有害結果(如發(fā)育異常，增加疾病易感性等)。在體外，動物和人類的研究已經確定了幾類環(huán)境化學物，可以修飾表觀遺傳標志，包括金屬、過氧化物酶體增殖劑、空氣污染物、毒物和內分泌干擾物/生殖毒物。目前環(huán)境化學物表觀遺傳標志的研究大多數集中在DNA甲基化，只有少數研究涉及組蛋白修飾和miRNA(表1～3)。外源化學物引起表觀遺傳學改變可影響細胞應激，并是潛在可逆的;也可能是可遺傳的。表觀遺傳毒性(epigenotoxicity)是指脫離外源化學物暴露后，可遺傳的有害改變。廣義的表觀遺傳毒性也可以包括外源化學物引起非遺傳的表觀遺傳學改變中介的外源化學物毒效應。可遺傳的表觀遺傳毒性和表觀遺傳改變中介的毒效應是有區(qū)別的。表觀遺傳毒性可以被分為有絲分裂的，減數分裂的或跨代遺傳的3類。表觀遺傳毒性這一新興研究領域對毒理學產生了重大的影響。下文主要討論目前表觀遺傳毒性測試的主要發(fā)現(xiàn)及國際生命科學研究所(ILSI)“評估表觀遺傳變化”的研討會的意見。

2表觀遺傳毒性的主要發(fā)現(xiàn)

2.1化學致癌近年來在多種腫瘤細胞觀察到表觀遺傳事件。表觀遺傳事件可能引起基因表達的變化通過DNA甲基化，組蛋白修飾和/或染色質重構。并估計，在腫瘤細胞中檢測到甲基化變化的數目遠遠多于遺傳改變的數目。研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳事件參與環(huán)境與職業(yè)因子誘發(fā)癌變進程的引發(fā)和進展。DNA甲基化異常對腫瘤發(fā)生有因果關系作用，甲基胞嘧啶增加突變可能性，增加致癌物結合，腫瘤抑制基因沉默，DNA修復基因沉默，癌的DNA低甲基化和遺傳學改變。組蛋白修飾可能通過影響DNA修復和細胞周期關卡，引起遺傳學改變。傳統(tǒng)的致癌性試驗可確定表觀遺傳修飾誘導腫瘤的可能性。許多不同的嚙齒類致肝癌物已被確定，而研究發(fā)現(xiàn)這些化合物的作用模式并無遺傳毒性，與人類也無關聯(lián)性。例如過氧化物酶體增殖物激活受體-α(PPAR-A)介導的和構成性雄甾烷受體(CAR)介導的嚙齒類動物癌變。肝腫瘤促長劑苯巴比妥(PB)，其與CAR的激活和隨后的效果相關。PB誘導的嚙齒類表觀遺傳學改變包括甲基化改變的區(qū)域，基因表達的特殊改變和外源性及內源性化合物的代謝。持續(xù)的核受體介導的肝臟致癌物的分子分析，將更加明確地表征每個受試化合物的作用模式。表觀基因組正常變異性的表征和與處理相關的表觀遺傳學影響的理解，將是研究致癌作用模式的巨大挑戰(zhàn)。

2.2遺傳毒理學評價化學物引起遺傳損傷的能力是風險評定的重要內容。表觀遺傳學影響基因表達的可遺傳的變化可能構成遺傳毒性。表觀遺傳導致基因改變的機制包括:錯配修復基因表觀遺傳缺陷，增加DNA修復基因表觀遺傳缺陷與癌癥特定突變譜相關，參與雙鏈斷裂修復的基因的表觀遺傳失活，有絲分裂關卡基因表觀遺傳缺陷，致癌物解毒基因與甲基胞嘧啶突變可能性增加，DNA全面低甲基化和染色體不穩(wěn)定等。已經確定表觀遺傳學改變在腫瘤形成中具有一定的作用。在腫瘤發(fā)展過程中DNA甲基化模式的改變往往是最早觀察到的分子事件。甲基胞嘧啶(5meC)已知是C∶G至T∶A轉換突變的熱點，起因于胞嘧啶自發(fā)性水解和酶脫氨基率的增加和DNA修復降低。增加的5meC脫氨基率和T堿基修復受限可解釋在CpG位點突變頻率的增加。人類腫瘤p53基因突變的1/4和腫瘤抑制基因p16的C-T轉換的1/3已知會發(fā)生在CpG位點上。突變的增加也可能來自于飲食中甲基供體的不足。已證明葉酸補充劑能減少潰瘍性結腸炎患者發(fā)生結腸癌的風險和和預防結腸癌細胞p53突變。參與葉酸代謝的酶遺傳多態(tài)性影響表觀遺傳標志，改變SAM水平，并能調節(jié)結腸癌的風險。也已提出DNA氧化性損傷在癌癥的發(fā)生、心血管疾病和衰老中所起的作用。8-羥基鳥嘌呤(8oxoG)改變了CpG二核苷酸相鄰的C的甲基轉移酶活性，可能改變DNA甲基化。在CpG內C5-位的損傷影響DNA甲基化。在體外，5meC和5-氯C因啟動子甲基化引起次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Hgprt)基因的沉默。此外，CpG內的8oxoG和HmC或顯著減少結合于DNA的MeCP2，并直接導致染色質結構改變。光二聚物，烷基化堿基，脫堿基位點，以及鏈斷裂也會誘導DNA的甲基化變化。對性細胞的致突變性將于下文討論。體外哺乳動物細胞基因突變試驗能夠篩選表觀遺傳學介導的危害。例如，在不同嚙齒類細胞系經5-氮胞苷處理TK基因可恢復活性。此外，DNA合成抑制劑3-疊氮基-3-脫氧胸苷(AZT)可引起TK位點超甲基化。應進一步開發(fā)篩選試驗以確定表觀遺傳學中介的遺傳毒性。

2.3發(fā)育與生殖的表觀遺傳毒理學完全分化的體細胞，在正常情況下，將有相對穩(wěn)定的表觀基因組傳遞到子代細胞。但在哺乳動物的發(fā)育過程中，早期胚胎發(fā)育過程(著床前)，以及在子宮內原始生殖細胞的發(fā)育過程中，有兩個表觀遺傳學的重編程階段，重新設置DNA的甲基化模式。這兩個發(fā)育的表觀遺傳重編程事件有可能是破壞表觀遺傳編程的敏感窗口。發(fā)育和生殖毒理學家特別感興趣的是毒物暴露是否可以直接改變發(fā)育的表觀基因組，有害的表型是否可跨代遺傳，及因此存在的潛在危害。表觀遺傳編程紊亂可能有助于對表型的跨代遺傳。使用Avy小鼠(黃色刺小鼠)模型，飲食暴露雙酚A，使Avy和CabpIAP亞穩(wěn)外延等位基因低甲基化。甲基供體膳食補充劑或染料木素可抵消此低甲基化效應。這些結果與造成表觀遺傳影響的其他內分泌干擾物報告一致。在環(huán)境相關水平低濃度的雙酚A(1.2和2.4μg/kg體重)對大鼠可誘導跨代遺傳表型異常。暴露于雙酚A圍生期雄性后代的精子計數和精子活力降低，并在F3代持續(xù)這些表型。甲氧滴滴涕和乙烯菌核利在子宮中暴露也會導致跨代生殖遺傳表型異常。雖然甲氧氯和乙烯菌核利在高于人類接觸的劑量觀察到病理學改變，但此研究提供了一個模型來研究表觀遺傳跨代的機制。已證明，乙烯菌核利暴露后破壞了多達3代的小鼠精子一些印跡基因甲基化模式，這表明跨代遺傳異常的表型也有表觀遺傳的基礎。

2.4免疫毒理學已發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳調控多能幼稚輔助性T細胞(Th)分化的啟動和其效應亞群的成熟。啟動后不久，幼稚T細胞同時轉錄低水平的Th1(CD4)和Th2(CD8)細胞因子，包括IL-2。在選擇性轉錄成為Ifng(Th1細胞因子標記)或Th2細胞因子基因(IL-4和IL-5，IL-13)之前需要幾次復制。在體外用5-aza誘導T細胞，導致由早先不產生這些細胞因子的T細胞系產生IL-2和IFN-g。在用組蛋白去乙酰酶抑制劑處理的CD4T細胞研究證實干擾素IFN-G和Th2型細胞因子的表達增強。上述研究結果表明，表觀遺傳機制是Th細胞分化和功能的關鍵因素。盡管與小鼠相比，人類IFNG基因缺乏脫甲基化，分化的人類Th細胞CpG甲基化分析顯示出與小鼠類似的結果。將化學物誘導的小鼠T細胞分化的表觀遺傳學改變數據外推到人應要謹慎。

2.5其他終點從鼠類模型或單一基因的表觀遺傳學的某些成果已被外推于人類疾病原因。表觀遺傳學基礎的表型被認為是人類疾病的起源有待進一步的研究，特別是確定表觀遺傳的正常變異和評價表觀遺傳影響需要適當的實驗設計和對照。已經提出，內分泌干擾物的表觀遺傳毒性可能導致暴露人群的許多發(fā)育，代謝和行為障礙。對其他靶器官或終點的表觀遺傳毒性還有待研究。

2.6檢測流程和模型Szyf2007年對檢測表觀遺傳毒性提出的研究思路為:①在生命一個時間點的環(huán)境暴露可能會改變表觀遺傳編程，導致穩(wěn)定改變表型和反應性，②毒物暴露可能導致表觀遺傳重編程，導致生命后期表型的變異。Reamon-Buettner和Borlak提出使用動物模型(如鼠類)環(huán)境暴露后分析表觀遺傳機制的研究方案，見圖1。已推薦了檢測表觀遺傳毒性的動物模型，特別是Avy小鼠和Axin1融合(Axin1Fu)小鼠能用于研究表觀遺傳學和發(fā)育畸形之間的聯(lián)系，因為在特定的DNA甲基化模式的改變可以與小鼠遺傳疾病廣泛鏈接。

3ILSI的“評估表觀遺傳變化”研討會

2009年10月ILSI的健康與環(huán)境科學研究所(IL-SI/HESI)主辦“評估表觀遺傳變化”研討會，評估和提高表觀遺傳學方面的科學知識基礎及其在疾病中的作用，包括跨代的表觀遺傳變化的影響，還討論了將表觀遺傳納入安全性評價的幾個問題。

3.1可能用于評價化學物產生表觀遺傳毒性的模型系統(tǒng)大鼠和/或兔可能是評價外源化學物產生表觀遺傳變化影響F1和/或F2和F3代的適當的模型。小鼠可能是更易于處理的模型，因為小鼠基因組有更多的數據，并已有用于檢測表觀遺傳變化的工具。已建議Avy小鼠模型作為潛在的篩查工具，其毛色受亞穩(wěn)Avy等位基因IAP隱蔽啟動子附近CpGs甲基化狀態(tài)的影響。然而，Avy小鼠模型用于篩選可能過于敏感。其他可能的模型包括斑馬魚和秀麗隱桿線蟲，以及蜜蜂和果蠅。體外模型是使用哺乳動物細胞或利用干細胞。干細胞包括其他物種不存在的印跡基因。印跡基因有可能作為確定表觀遺傳改變的感應器。以上討論的模型有可能用于潛在危害識別，并提供機制基礎。然而，將很難直接解釋這些數據對整體動物和人類的意義。在表觀遺傳模型轉化為管理決策測試之前，需要進行大量的基礎工作和驗證研究。

3.2可能評價的終點/靶對于表觀遺傳變化的指標，應確定適應反應還是有害反應。確定表觀遺傳修飾與可能提示特定有害影響的疾病相關基因表達改變之間的因果關系或強的關聯(lián)需要表型錨定。在發(fā)現(xiàn)受影響的表觀遺傳效應的基因與某種疾病相關的基礎上，應建立由表觀遺傳機制調控的基因數據庫。表觀遺傳效應很可能有物種，組織，暴露和時間特異性。目前，在研究中實驗對照組是化合物反應表觀遺傳變化的最適當的參照，建立表觀遺傳印跡的參考對照范圍可能是有意義的，因為這些區(qū)域甲基化模式可能更趨于穩(wěn)定和遺傳。

3.3可能應用的技術關于DNA甲基化和miRNA，以陣列為基礎的平臺，針對人類和小鼠樣品已優(yōu)化。針對大鼠可用的工具有限，但可用根據大鼠基因組序列基于陣列的高通量方法。雖然硫酸氫鹽為基礎的測序評價DNA甲基化方法可用于所有物種，但需要發(fā)展高通量測序方法。區(qū)分異常信號和背景信號并不容易，最大的挑戰(zhàn)將是數據分析和解釋，應發(fā)展信息學。

3.4管理機構的觀點為了將表觀遺傳毒性納入風險評定，有很多的考慮。必須明確的問題，理解環(huán)境、營養(yǎng)和/或藥物暴露對個人，群體及跨代水平的公共健康的潛在長期影響，界定希望解決的問題，確定模型系統(tǒng)。這就需要努力使與有害結局和基線改變相聯(lián)系的研究設計、方法和模型標準化。以適當的參考化合物、途徑和劑量驗證該模型。模型試驗檢測的任何變化必須以合理的方式鏈接到表型或臨床結局。對于法規(guī)測試，方法必須標準化，具有重復性和重現(xiàn)性。為了將表觀遺傳數據有效地納入人類風險評定，最好與管理機構共同努力，確定一個正常基線范圍，并與有害結局關聯(lián)，界定公共衛(wèi)生關注的適當水平。管理機構將需要開發(fā)分析工具，以對公共健康方面的數據進行解釋，并將此類數據應用于風險評定模式和慢性健康結局。

4小結

關注外源化學物引起表觀遺傳學變化可能產生的有害健康影響具有重要的意義。本文初步提出表觀遺傳毒性和由表觀遺傳學改變中介的毒性的概念，主要介紹了外源化學物的表觀遺傳毒性的研究現(xiàn)況和與納入安全性評價的ILSI的討論。為更好地理解表觀遺傳學領域及其與安全評估的關系，應重視識別表觀遺傳毒性的毒理學研究的終點、發(fā)展實驗模型和對結果的解釋，并將此類數據應用于風險評定模式。這些努力有可能形成新興的科學領域———表觀遺傳毒理學(epigenotoxicology)。