Ames試驗的繼承毒理學研究范文

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作者：田逸君張?zhí)鞂氈煊衿今R璽里畢潔鄭怡文單位：中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學衛(wèi)生毒理學教研室上海

降纖酶（defibrase）已在臨床廣泛應用，如去纖、抗凝、調(diào)脂、擴張血管和改善微循環(huán)等，但作為異源蛋白，其在使用中不可避免地具有蛋白質(zhì)類藥物的共同缺點，如具免疫原性、半衰期短、穩(wěn)定性差等。聚乙二醇修飾技術(shù)是近年來發(fā)展的用于改進蛋白質(zhì)類藥物體內(nèi)藥動學性質(zhì)的新技術(shù)，它將單甲氧基聚乙二醇分子鍵合到蛋白質(zhì)分子表面，改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，進而改變其生化性質(zhì)。此法可有效降低蛋白質(zhì)的免疫原性，延長半衰期，減少給藥次數(shù)。本實驗的受試物是一種供注射用的含有聚乙二醇修飾降纖酶的藥物組合物。為評價其是否具有遺傳毒性，本研究應用鼠傷寒沙門菌回復突變試驗（亦稱ames試驗）、體外培養(yǎng)中國倉鼠卵巢（CHO）細胞染色體畸變試驗和小鼠骨髓微核試驗方法進行了檢測，目的是為聚乙二醇修飾降纖酶的臨床前毒性評價提供資料。實驗材料與動物受試物：聚乙二醇修飾降纖酶（純度：98．9％，含量：200U•mL－1，批號：20070501），由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院生物制藥部提供，無色澄明液體。菌株：組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門菌（S．typhimurium）TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535菌株，由復旦大學公共衛(wèi)生學院環(huán)境衛(wèi)生學教研室贈予，貯存于液氮中。實驗前進行菌株鑒定（R因子鑒定、自發(fā)回變數(shù)鑒定），均符合規(guī)定標準。S9代謝活化系統(tǒng)是從經(jīng)過酶誘導劑處理的嚙齒類動物的肝臟所提取的帶有輔助因子和微粒體部分，購于美國MOLTOX公司。CHO細胞由復旦大學公共衛(wèi)生學院毒理教研室贈予。ICR小鼠（SPF級）共50只，每組10只，雌雄各半，7～8wk齡，體重19～21g，由上海西普爾－必凱實驗動物有限公司提供，實驗動物質(zhì)量合格證號：0047004。

實驗方法與分組按《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導原則》及《ICH藥品注冊的國際技術(shù)要求（安全性部分）》的相關要求，應用Ames試驗[6]、體外培養(yǎng)CHO細胞染色體畸變試驗和小鼠骨髓微核試驗[8]檢測聚乙二醇修飾降纖酶的遺傳毒性，分別從DNA損傷、基因突變和染色體畸變3個方面進行遺傳毒性評價。

Ames試驗：采用標準平板摻入法，使細菌在加或不加代謝活化系統(tǒng)（±S9）條件下接觸受試物，5個菌株（TA97、TA98、TA100、TA102及TA1535）均設100、20、4、0．8、0．16U5個劑量組，每培養(yǎng)皿均加入相應濃度的受試物溶液0．1mL，此外設空白對照、溶劑對照和陽性對照，每個劑量組及對照組均設3個平行皿。＋S9陽性對照：TA97、TA98及TA100為2－氨基芴（每皿10μg），TA102為1，8－二羥基蒽醌（每皿50μg），TA1535為環(huán)磷酰胺（每皿50μg）；－S9陽性對照：TA97和TA98為對二甲基氨基苯重氮磺酸鈉（每皿50μg），TA100和TA102為甲基磺酸甲酯（每皿1μg），TA1535為4－硝基喹啉－N－氧化物（每皿0．5μg）；溶劑：0．85％NaCl溶液。

體外培養(yǎng)CHO細胞染色體畸變試驗：使細胞在加或不加代謝活化系統(tǒng)（±S9）條件下接觸受試物，高劑量組為委托單位提供的受試物原液可以達到的最高濃度10U•mL－1，再分別以5．0、2．5U•mL－1作為中、低劑量，共設3個劑量組；試驗時在10mL的試驗體系中分別加入各濃度應用液500μL，另設陽性對照和溶劑對照。＋S9陽性對照：環(huán)磷酰胺60mg•L－1，－S9陽性對照：絲裂霉素C0．5mg•L－1，溶劑：0．85％NaCl溶液。

小鼠骨髓微核試驗：采用小鼠尾靜脈注射給藥，劑量分別為425、850、1700U•kg－1（分別約相當于1／8、1／4、1／2的小鼠經(jīng)靜脈LD50劑量），給藥容積為10mL•kg－1體重；同時設溶劑對照組和陽性對照。溶劑對照組給藥方式與受試物組相同，以尾靜脈注射給予溶劑（0．85％NaCl溶液）；陽性對照組以40mg•kg－1體重的劑量腹腔注射一次給予環(huán)磷酰胺，給藥容量均為10mL•kg－1體重。

統(tǒng)計學方法Ames試驗結(jié)果的評價是以比較受試物各劑量組與溶劑對照組的回復突變菌落數(shù)為基礎，若某劑量組回復突變菌落數(shù)為溶劑對照組回復突變菌落數(shù)的2倍以上，呈現(xiàn)可重復性，并在一定的劑量范圍內(nèi)存在著劑量－反應關系，則判斷為陽性。染色體畸變試驗的畸變率和小鼠骨髓微核試驗的微核率均采用χ2檢驗與溶劑對照組進行比較，檢驗標準以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果1Ames試驗受試物各劑量組和對照組的平皿均未見污染，并且可見背景菌生長。5個菌株的自發(fā)回復突變菌落數(shù)以及陽性對照品誘發(fā)的回復突變菌落數(shù)均在本實驗室Ames試驗歷史對照范圍內(nèi)，并且各菌株陽性對照組的回復突變菌落數(shù)與空白對照組相比顯著增加，提示本試驗系統(tǒng)符合實驗要求。在最高劑量已達到每皿100U的受試條件下，未觀察到受試物的抑菌現(xiàn)象。各劑量組受試物在加或不加代謝活化系統(tǒng)（±S9）時對TA97、TA98、TA100、TA102及TA1535所誘發(fā)的回復突變菌落數(shù)均與溶劑對照的突變菌落數(shù)相近，并且未觀察到明顯的劑量－反應關系。結(jié)果見表1。

2體外培養(yǎng)CHO細胞染色體畸變試驗染色體分析結(jié)果顯示，陽性對照組受試細胞染色體的畸變率明顯增高，加或不加代謝活化系統(tǒng)（±S9）24h染色體畸變率分別為21％和20％，不加S9代謝活化系統(tǒng)時的48h染色體畸變率為17％，與溶劑對照組相比均有顯著差異（P＜0．05）。2．5、5．0和10．0U•mL－1受試物在加代謝活化系統(tǒng)（＋S9）24h染色體畸變率分別為2％、0％和3％，不加代謝活化系統(tǒng)（－S9）24h染色體畸變率分別為0％、2％和0％，不加代謝活化系統(tǒng)（－S9）48h染色體畸變率分別為1％、1％和3％。受試物各劑量組細胞染色體畸變率均小于5％，與溶劑對照組結(jié)果相比較其差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。結(jié)果見表2、表3。

3小鼠骨髓微核試驗的結(jié)果受試物在425、850、1700U•kg－1的劑量下對ICR小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核誘發(fā)率分別為（3．53±1．29）‰、（4．91±1．46）‰和（4．24±1．78）‰，與溶劑對照組相比均無統(tǒng)計學差異（P＞0．05），并且在各受試劑量下未觀察到受試物對小鼠骨髓的抑制作用。結(jié)果見表4。

討論Ames試驗是被世界各國廣為采用的檢測物質(zhì)致突變性的實驗，該法比較快速、簡便、敏感、經(jīng)濟，是經(jīng)典的測試化學物或藥物致突變性實驗。染色體畸變分析是采用CHO細胞體外培養(yǎng)的方法進行的，CHO細胞在加或不加代謝活化系統(tǒng)（±S9）的條件下，與受試物接觸一定時間后，用秋水仙堿處理，使細胞的有絲分裂停止在中期相，以增加處于中期相的細胞數(shù)；然后收集細胞，經(jīng)低滲、固定、涂片和染色后，在顯微鏡下觀察染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)的改變，檢測受試物的誘變性。微核試驗是檢測外來化合物對染色體損傷作用的重要方法。凡能使染色體發(fā)生斷裂或使染色體和紡錘體聯(lián)結(jié)損傷的化學物，都可用微核試驗來檢測。這3項實驗分別從體外到體內(nèi)，從微生物、離體細胞和整體動物水平上系統(tǒng)評價該藥物的遺傳毒性，是《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導原則》推薦的標準試驗組合。本研究結(jié)果顯示，聚乙二醇修飾降纖酶在每平皿100、20、4、0．8、0．16U的受試劑量下，在加或不加代謝活化系統(tǒng)（S9）時對TA97、TA98、TA100、TA102及TA1535所誘發(fā)的回復突變菌落數(shù)均與溶劑對照的突變菌落數(shù)相近，顯示其在受試濃度下對鼠傷寒沙門菌均無致突變性；聚乙二醇修飾降纖酶2．5、5．0和10．0U•mL－13個劑量組在加代謝活化系統(tǒng)（＋S9）于24h和不加代謝活化系統(tǒng)（－S9）于24h、48h培養(yǎng)的CHO細胞染色體畸變率與溶劑對照組比較均無統(tǒng)計學差異，顯示其在受試劑量下無致CHO細胞染色體畸變效應；聚乙二醇修飾降纖酶425、850、1700U•kg－13個劑量組對ICR小鼠的微核誘發(fā)率與溶劑對照組比較均無統(tǒng)計學差異，顯示其在受試劑量下對ICR小鼠無誘發(fā)骨髓嗜多染紅細胞微核的效應。綜上，本研究結(jié)果表明聚乙二醇修飾降纖酶在本實驗條件下無遺傳毒性。