Ames試驗(yàn)的繼承毒理學(xué)研究范文

本站小編為你精心準(zhǔn)備了Ames試驗(yàn)的繼承毒理學(xué)研究參考范文，愿這些范文能點(diǎn)燃您思維的火花，激發(fā)您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

作者：田逸君張?zhí)鞂氈煊衿今R璽里畢潔鄭怡文單位：中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)衛(wèi)生毒理學(xué)教研室上海

降纖酶（defibrase）已在臨床廣泛應(yīng)用，如去纖、抗凝、調(diào)脂、擴(kuò)張血管和改善微循環(huán)等，但作為異源蛋白，其在使用中不可避免地具有蛋白質(zhì)類藥物的共同缺點(diǎn)，如具免疫原性、半衰期短、穩(wěn)定性差等。聚乙二醇修飾技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展的用于改進(jìn)蛋白質(zhì)類藥物體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)的新技術(shù)，它將單甲氧基聚乙二醇分子鍵合到蛋白質(zhì)分子表面，改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變其生化性質(zhì)。此法可有效降低蛋白質(zhì)的免疫原性，延長(zhǎng)半衰期，減少給藥次數(shù)。本實(shí)驗(yàn)的受試物是一種供注射用的含有聚乙二醇修飾降纖酶的藥物組合物。為評(píng)價(jià)其是否具有遺傳毒性，本研究應(yīng)用鼠傷寒沙門菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（亦稱ames試驗(yàn)）、體外培養(yǎng)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)和小鼠骨髓微核試驗(yàn)方法進(jìn)行了檢測(cè)，目的是為聚乙二醇修飾降纖酶的臨床前毒性評(píng)價(jià)提供資料。實(shí)驗(yàn)材料與動(dòng)物受試物：聚乙二醇修飾降纖酶（純度：98．9％，含量：200U•mL－1，批號(hào)：20070501），由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院生物制藥部提供，無(wú)色澄明液體。菌株：組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門菌（S．typhimurium）TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535菌株，由復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室贈(zèng)予，貯存于液氮中。實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行菌株鑒定（R因子鑒定、自發(fā)回變數(shù)鑒定），均符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。S9代謝活化系統(tǒng)是從經(jīng)過(guò)酶誘導(dǎo)劑處理的嚙齒類動(dòng)物的肝臟所提取的帶有輔助因子和微粒體部分，購(gòu)于美國(guó)MOLTOX公司。CHO細(xì)胞由復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理教研室贈(zèng)予。ICR小鼠（SPF級(jí)）共50只，每組10只，雌雄各半，7～8wk齡，體重19～21g，由上海西普爾－必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：0047004。

實(shí)驗(yàn)方法與分組按《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》及《ICH藥品注冊(cè)的國(guó)際技術(shù)要求（安全性部分）》的相關(guān)要求，應(yīng)用Ames試驗(yàn)[6]、體外培養(yǎng)CHO細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)和小鼠骨髓微核試驗(yàn)[8]檢測(cè)聚乙二醇修飾降纖酶的遺傳毒性，分別從DNA損傷、基因突變和染色體畸變3個(gè)方面進(jìn)行遺傳毒性評(píng)價(jià)。

Ames試驗(yàn)：采用標(biāo)準(zhǔn)平板摻入法，使細(xì)菌在加或不加代謝活化系統(tǒng)（±S9）條件下接觸受試物，5個(gè)菌株（TA97、TA98、TA100、TA102及TA1535）均設(shè)100、20、4、0．8、0．16U5個(gè)劑量組，每培養(yǎng)皿均加入相應(yīng)濃度的受試物溶液0．1mL，此外設(shè)空白對(duì)照、溶劑對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)劑量組及對(duì)照組均設(shè)3個(gè)平行皿。＋S9陽(yáng)性對(duì)照：TA97、TA98及TA100為2－氨基芴（每皿10μg），TA102為1，8－二羥基蒽醌（每皿50μg），TA1535為環(huán)磷酰胺（每皿50μg）；－S9陽(yáng)性對(duì)照：TA97和TA98為對(duì)二甲基氨基苯重氮磺酸鈉（每皿50μg），TA100和TA102為甲基磺酸甲酯（每皿1μg），TA1535為4－硝基喹啉－N－氧化物（每皿0．5μg）；溶劑：0．85％NaCl溶液。

體外培養(yǎng)CHO細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)：使細(xì)胞在加或不加代謝活化系統(tǒng)（±S9）條件下接觸受試物，高劑量組為委托單位提供的受試物原液可以達(dá)到的最高濃度10U•mL－1，再分別以5．0、2．5U•mL－1作為中、低劑量，共設(shè)3個(gè)劑量組；試驗(yàn)時(shí)在10mL的試驗(yàn)體系中分別加入各濃度應(yīng)用液500μL，另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和溶劑對(duì)照。＋S9陽(yáng)性對(duì)照：環(huán)磷酰胺60mg•L－1，－S9陽(yáng)性對(duì)照：絲裂霉素C0．5mg•L－1，溶劑：0．85％NaCl溶液。

小鼠骨髓微核試驗(yàn)：采用小鼠尾靜脈注射給藥，劑量分別為425、850、1700U•kg－1（分別約相當(dāng)于1／8、1／4、1／2的小鼠經(jīng)靜脈LD50劑量），給藥容積為10mL•kg－1體重；同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照。溶劑對(duì)照組給藥方式與受試物組相同，以尾靜脈注射給予溶劑（0．85％NaCl溶液）；陽(yáng)性對(duì)照組以40mg•kg－1體重的劑量腹腔注射一次給予環(huán)磷酰胺，給藥容量均為10mL•kg－1體重。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法Ames試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)是以比較受試物各劑量組與溶劑對(duì)照組的回復(fù)突變菌落數(shù)為基礎(chǔ)，若某劑量組回復(fù)突變菌落數(shù)為溶劑對(duì)照組回復(fù)突變菌落數(shù)的2倍以上，呈現(xiàn)可重復(fù)性，并在一定的劑量范圍內(nèi)存在著劑量－反應(yīng)關(guān)系，則判斷為陽(yáng)性。染色體畸變試驗(yàn)的畸變率和小鼠骨髓微核試驗(yàn)的微核率均采用χ2檢驗(yàn)與溶劑對(duì)照組進(jìn)行比較，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果1Ames試驗(yàn)受試物各劑量組和對(duì)照組的平皿均未見(jiàn)污染，并且可見(jiàn)背景菌生長(zhǎng)。5個(gè)菌株的自發(fā)回復(fù)突變菌落數(shù)以及陽(yáng)性對(duì)照品誘發(fā)的回復(fù)突變菌落數(shù)均在本實(shí)驗(yàn)室Ames試驗(yàn)歷史對(duì)照范圍內(nèi)，并且各菌株陽(yáng)性對(duì)照組的回復(fù)突變菌落數(shù)與空白對(duì)照組相比顯著增加，提示本試驗(yàn)系統(tǒng)符合實(shí)驗(yàn)要求。在最高劑量已達(dá)到每皿100U的受試條件下，未觀察到受試物的抑菌現(xiàn)象。各劑量組受試物在加或不加代謝活化系統(tǒng)（±S9）時(shí)對(duì)TA97、TA98、TA100、TA102及TA1535所誘發(fā)的回復(fù)突變菌落數(shù)均與溶劑對(duì)照的突變菌落數(shù)相近，并且未觀察到明顯的劑量－反應(yīng)關(guān)系。結(jié)果見(jiàn)表1。

2體外培養(yǎng)CHO細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)染色體分析結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照組受試細(xì)胞染色體的畸變率明顯增高，加或不加代謝活化系統(tǒng)（±S9）24h染色體畸變率分別為21％和20％，不加S9代謝活化系統(tǒng)時(shí)的48h染色體畸變率為17％，與溶劑對(duì)照組相比均有顯著差異（P＜0．05）。2．5、5．0和10．0U•mL－1受試物在加代謝活化系統(tǒng)（＋S9）24h染色體畸變率分別為2％、0％和3％，不加代謝活化系統(tǒng)（－S9）24h染色體畸變率分別為0％、2％和0％，不加代謝活化系統(tǒng)（－S9）48h染色體畸變率分別為1％、1％和3％。受試物各劑量組細(xì)胞染色體畸變率均小于5％，與溶劑對(duì)照組結(jié)果相比較其差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

3小鼠骨髓微核試驗(yàn)的結(jié)果受試物在425、850、1700U•kg－1的劑量下對(duì)ICR小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核誘發(fā)率分別為（3．53±1．29）‰、（4．91±1．46）‰和（4．24±1．78）‰，與溶劑對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05），并且在各受試劑量下未觀察到受試物對(duì)小鼠骨髓的抑制作用。結(jié)果見(jiàn)表4。

討論Ames試驗(yàn)是被世界各國(guó)廣為采用的檢測(cè)物質(zhì)致突變性的實(shí)驗(yàn)，該法比較快速、簡(jiǎn)便、敏感、經(jīng)濟(jì)，是經(jīng)典的測(cè)試化學(xué)物或藥物致突變性實(shí)驗(yàn)。染色體畸變分析是采用CHO細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法進(jìn)行的，CHO細(xì)胞在加或不加代謝活化系統(tǒng)（±S9）的條件下，與受試物接觸一定時(shí)間后，用秋水仙堿處理，使細(xì)胞的有絲分裂停止在中期相，以增加處于中期相的細(xì)胞數(shù)；然后收集細(xì)胞，經(jīng)低滲、固定、涂片和染色后，在顯微鏡下觀察染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)的改變，檢測(cè)受試物的誘變性。微核試驗(yàn)是檢測(cè)外來(lái)化合物對(duì)染色體損傷作用的重要方法。凡能使染色體發(fā)生斷裂或使染色體和紡錘體聯(lián)結(jié)損傷的化學(xué)物，都可用微核試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)。這3項(xiàng)實(shí)驗(yàn)分別從體外到體內(nèi)，從微生物、離體細(xì)胞和整體動(dòng)物水平上系統(tǒng)評(píng)價(jià)該藥物的遺傳毒性，是《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》推薦的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合。本研究結(jié)果顯示，聚乙二醇修飾降纖酶在每平皿100、20、4、0．8、0．16U的受試劑量下，在加或不加代謝活化系統(tǒng)（S9）時(shí)對(duì)TA97、TA98、TA100、TA102及TA1535所誘發(fā)的回復(fù)突變菌落數(shù)均與溶劑對(duì)照的突變菌落數(shù)相近，顯示其在受試濃度下對(duì)鼠傷寒沙門菌均無(wú)致突變性；聚乙二醇修飾降纖酶2．5、5．0和10．0U•mL－13個(gè)劑量組在加代謝活化系統(tǒng)（＋S9）于24h和不加代謝活化系統(tǒng)（－S9）于24h、48h培養(yǎng)的CHO細(xì)胞染色體畸變率與溶劑對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，顯示其在受試劑量下無(wú)致CHO細(xì)胞染色體畸變效應(yīng)；聚乙二醇修飾降纖酶425、850、1700U•kg－13個(gè)劑量組對(duì)ICR小鼠的微核誘發(fā)率與溶劑對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，顯示其在受試劑量下對(duì)ICR小鼠無(wú)誘發(fā)骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的效應(yīng)。綜上，本研究結(jié)果表明聚乙二醇修飾降纖酶在本實(shí)驗(yàn)條件下無(wú)遺傳毒性。