DNA在毒物學中的運用范文
本站小編為你精心準備了DNA在毒物學中的運用參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。
作者：劉靜張金曉胡金芳申秀萍劉昌孝單位：天津藥物研究院天津中醫藥大學
隨著對基因組結構和功能研究的深入及基因芯片技術的發展，基因芯片技術也逐漸應用于研究藥物的毒性作用及其作用機制。基因芯片技術也被稱為dna微陣列（DNAarray），寡核苷酸微芯片（oligonucleotidemicrochip）或寡核苷酸微陣列（oligonucleotidemicroarray）。它利用大規模集成的手段將千百萬個DNA探針有規律地排列在固相支持物上，再將要研究的樣品DNA／RNA通過PCR擴增、體外轉錄等技術摻入熒光標記分子，然后在芯片上與探針雜交，通過共聚焦顯微鏡或電光倍增管進行激光誘導熒光掃描，并配合計算機系統對每個探針上的熒光信號進行比較和定量分析，從而獲得樣品中大量基因序列及表達的信息。其最顯著的特點是高通量、高集成、多樣化和自動化。根據用途的不同，基因芯片分類為基因表達芯片和基因測序芯片。與藥物毒理學研究關系密切的為基因表達芯片。隨著基因芯片技術的發展，從新藥的篩選、毒理安全性評價到臨床應用，基因芯片技術將成為貫穿整個藥物毒理學研究的重要技術。
1尋找毒性作用標志物
安全性和有效性是藥物的兩大基本屬性，而藥物毒理學研究正是對藥物的安全性進行研究，以觀察藥物是否具有毒性作用及其可能的作用機制。傳統的毒理學實驗方法測定指標針對性不強，反映的毒性靶點不確切，但基因芯片技術可以利用基因表達芯片，找出藥物作用于機體后的表達差異基因，再對不同類型的藥物所對應的基因表達譜進行分類總結，找出其特征性的表達規律。這樣不同作用途徑的化合物都可以找到其特有的標志基因。當積累足夠多的基因表達圖譜數據，就可以建立毒物的毒理效應數據庫。這樣，當對毒性作用不清的藥物進行研究時，就可以將該藥物的基因表達圖譜與毒理效應數據庫比對，從而找出其毒性作用靶點。特別是在藥物致癌性的研究中，利用基因組學技術，建立與致癌性相關的標志基因數據庫，就能很快的探測新的藥物的致癌性，從而縮短致癌性研究周期。
Kazunari等利用基因芯片技術尋找致癌標志基因，從而建立短期的藥物致癌性研究的生物鑒定系統。17種肝致癌性藥物、8種其他器官致癌性藥物及14種無致癌性藥物處理大鼠肝癌細胞MH1C13d，分析肝致癌性藥物及無致癌性藥物組間、致癌藥物及無致癌性藥物組間及肝致癌性藥物及其他致癌性藥物組間基因表達的變化，尋找到藥物肝致癌作用標記基因。毒理學家通過尋找出來的某種特定毒性作用的標志基因或生物標志物將藥物進行分類，如有致癌性藥物和無致癌性藥物、有遺傳毒性和無遺傳毒性藥物、有肝毒性作用無腎毒性作用藥物和肝腎毒性均有的藥物等等，以便更好的對藥物的作用特點進行研究。vanDelft等分析了16種藥物的基因表達圖譜，找出具有遺傳毒性和不具有遺傳毒性的致癌藥物的表達差異基因，并驗證了6種致癌藥物有無遺傳毒性。在建立了毒性作用的標記基因的基礎上通過進一步建立合適的生物模型系統，便可通過基因表達譜變化來反映藥物對人體的毒性。并且也可以將與毒性作用相關聯的差異表達基因編碼的功能蛋白作為毒性作用標志物，用于監控及指導臨床用藥。Sul等將大鼠分別暴露于正常空氣及含有5×10−6、1×10−5的甲醛的空氣中，連續2周，每天6h，每周5d。取肺組織進行基因差異表達分析，研究發現21個表達差異的基因，其中上調基因2個，下調基因19個，其中羥甲基膽汁合酶、谷胱甘肽還原酶、碳酸苷酶2、利納肽受體3、跨膜酶體關聯蛋白5等9個基因被定量RT-PCR確定，希望能作為甲醛引起的人類相關病變的潛在生物標記物。Rokushima等通過靜脈給予頭孢噻啶后分析Fischer344大鼠腎基因表達圖譜，找出具有時間、劑量依賴關系的差異表達基因，發現腎損傷分子-1（kim-1）可以作為頭孢類抗菌素腎損傷的監測指標。
2藥物毒性作用機制
目前，明確藥物的毒性作用機制已經成為新藥風險評估的一個主要部分。采用傳統的分子生物學技術對藥物進行毒理學研究，雖然能對藥物的部分毒理機制進行研究，但一次僅能檢測部分毒性作用產物的量、個別酶活性變化及個別基因表達變化，不能反映藥物整體的毒性作用。而基因芯片可同時檢測數千個基因對藥物的反應，具有一次檢測信息量大、快速、高效、準確、靈敏度高等優點，而且Waring和連冬生等發現具有相似毒性機制的化合物所獲得的基因表達譜具有相似性，因而，基因芯片技術技術逐漸成為研究藥物毒性作用機制的有效方法之一，在藥物毒理機制的研究中的應用也越來越廣泛。
近年，具有肝毒性、腎毒性等常見毒性作用的藥物毒性機制研究較多，國內外應用基因組學技術進行藥物肝、腎毒性作用機制等研究也常有報道，形成了較為豐富的肝、腎毒性基因差異表達圖譜數據。Waring等和高利宏等均對肝、腎毒性基因差異表達圖譜數據進行聚類分析，根據不同的肝、腎毒性作用機制對藥物的基因表達圖譜進行分類，使新藥的肝、腎毒性作用機制研究更加確切。Akira等利用基因組學技術進行三氧化二砷（As2O3）腎毒性的作用機制研究，發現73個差異表達基因，通過分析，發現其腎毒性作用與HMOX1基因（編碼血紅素加氧酶）表達增加和活性氧族增加導致的細胞毒性有關，并且其細胞毒性作用可被α-類脂酸和活性氧族抑制劑等抑制。施暢等利用大鼠和人的全基因組芯片，分析Bay41-4109對大鼠肝臟和人肝細胞基因表達譜的影響，結果顯示引起大鼠肝臟發生差異表達的基因有41個，顯示Bay41-4109的肝毒性與藥物代謝酶表達異常以及脂肪能量代謝異常有關。而耳毒性、腦毒性、免疫毒性等毒性作用也有國內外毒理學家進行研究，但報道相對較少。陳平等采用基因表達譜芯片對大劑量水楊酸鹽注射后的大鼠耳蝸和正常耳蝸進行基因差異表達分析，研究水楊酸鹽所致的耳聾和耳鳴等耳毒性的分子機制。結果顯示表達上調2倍以上的基因和表達序列標簽（expressedsequencetags,ESTs）有42個，下調2倍以上的有49個。這些基因編碼通道蛋白、信號分子、轉錄因子、細胞因子和各種酶類，也有許多功能未知基因，表明水楊酸鈉影響各種離子通道和突觸蛋白基因。洪巖等應用基因芯片技術觀察As2O3對小鼠小腦組織氧化還原相關酶基因表達譜的影響。與對照組比較，染砷組中差異表達2倍以上的基因有18條，顯示As2O3對小鼠小腦的氧化還原相關酶基因表達譜具有明顯的影響，提示這些小腦氧化還原相關酶基因很可能是砷的神經毒作用的靶點。目前，國外毒理學家也逐漸應用基因組學技術進行遺傳毒性、致癌性等特殊毒性的作用機制研究。
3發現藥物潛在的毒性
對藥物進行毒性安全評價，是藥物篩選過程中十分重要的一個環節。目前藥物毒理學研究多通過大量的動物實驗來確定藥物的潛在毒性，這種方法測定指標固定，需要依賴病理組織學檢查，毒性作用容易出現假陰性。基因芯片技術可將藥物毒性與基因表達特征聯系起來，通過基因表達分析確定藥物毒性，使得藥物毒性或不期望出現的效應在臨床試驗前得以確認。而且，基因芯片可以在一個實驗中同時對成千上萬個基因的表達情況進行分析，可以反映藥物對動物整體基因表達的影響，從而發現常規毒理試驗測定指標中難以發現的毒性作用。在藥物的早期研發過程中，利用基因芯片技術對藥物的有效性及作用機制進行確認時，由于基因芯片能反映機體整體基因對藥物的應激作用，根據統計分析，找出有顯著差異表達的基因，分析其藥理作用相關基因及毒理作用相關基因，對于藥效劑量水平下藥物的潛在毒性也能發現。Kiela和楊義強等在研究印度齒葉乳香樹BoswelliaserrataRoxb的提取物時發現該藥高劑量不僅不改善腸炎的癥狀，而且利用基因芯片分析肝臟基因的表達譜時發現，高劑量組中與脂質代謝相關的大量基因表達失調，表明高劑量給藥時，該藥具有肝毒性。
在針對藥物某個特定的毒性作用進行機制研究時，利用基因芯片技術做基因表達分析，在發現該毒性的機制時，同樣也能發現該藥是否具有其他的潛在毒性作用，為進一步研究該藥的毒性作用指明方向。
4混合藥物中相互作用方式和機制
含有不同種類及比例的藥物混合可產生協同、相加或拮抗等毒性效應。利用基因芯片技術可將在混合藥物作用下的基因表達改變與在單一毒物作用下的基因表達比較，觀察基因表達差異，其毒理效應是否大于、小于或等于單一毒物的毒理效應，并可以根據藥物混合產生的協同、相加或拮抗等毒性效應來指導臨床用藥。藥物混合產生毒性作用協同或相加，則表明這種混合會增加藥物毒性，臨床應禁止混合藥物中的聯合用藥；藥物混合產生毒性作用拮抗，則表明混合藥物中某種或幾種藥物對其中的具有毒性作用的藥物具有減毒作用，可以用來治療該藥物引起的毒性作用。Mandimika等研究了α-查茄堿、α-龍葵堿以及α-查茄堿–α-龍葵堿不同比例（2.8∶1、1.7∶1）對人腸細胞株Caco-2基因表達的影響，并結合乳酸脫氫酶（LDH）的變化，分析α-查茄堿、α-龍葵堿相互作用的關系及機制。
發現在α-查茄堿–α-龍葵堿為1.7∶1時具有協同作用。Kim等亦從基因表達譜的整體水平探討14種化合物及1種混合物對大腸桿菌基因表達的不同影響。
5進行高通量篩選新藥毒性
現在藥物毒性安全評價研究多通過嚙齒類、犬和猴等動物模型來確定藥物的潛在毒性，分為急性毒性試驗、長期毒性試驗、特殊毒性試驗、致癌性試驗等。急性毒性試驗僅能篩選出毒性作用較強的藥物，而長期毒性試驗、特殊毒性試驗、致癌性試驗等需要使用大劑量的藥物，試驗周期長、費用高，不利于新藥的前期篩選。而基因組學技術的高敏感、高信息量優越性，使其在新藥篩選中的應用越來越廣泛。利用基因芯片技術，從體外模型系統中，可以快速分析待測藥物對基因表達譜的影響，就能在藥物研發的早期階段很方便地鑒別出藥物的藥理作用及其毒理作用。這種方法用藥量少、周期短，可以同時對多種藥物進行分析，減少實驗動物的使用，從而節省動物、人力、財力、物力和時間。
Kazunari等用17種肝致癌性藥物、8種其他器官致癌性藥物及14種無致癌性藥物處理大鼠肝癌細胞MH1C1，基因表達圖譜分析，找到致癌標志基因，從而建立短期的藥物致癌性研究的生物鑒定系統。并利用該系統進行了另外9種樣品的致癌性檢測，準確率達到88.9%。
6毒性作用與基因多態性相關性研究
不同的物種，由于基因的不同，對同一藥物的反應也不同。利用基因芯片技術可對單個或多個藥物進行分析，推斷藥物對不同生物的毒性可比性，找出敏感動物或敏感基因，并為將其作用外推到人提供依據。Sano等利用基因芯片技術，分析三氯乙烯誘導的肝毒性引起的基因表達變化在小鼠及大鼠之間的種屬差異，以便進一步研究三氯乙烯對人的肝毒性的作用與不同基因的關系。結果發現三氯乙烯對小鼠的TGF-β通路和蛋白激酶信號通路有影響，而對大鼠則無顯著性影響。在人類基因組中，平均每1000bp就有一個單核苷酸多態，若這種堿基的多態性出現在調控毒性反應的基因上，將會影響個體對藥物的耐受性或易感性，甚至有少數人表現為對某些藥物毒性作用具有“高敏感性”。因此，基因的多態性與藥物毒性作用強度之間存在一定關聯。根據不同人群對同一藥物的反應不同，利用基因芯片技術將人群快速分群，尋找對該藥物毒性作用敏感的基因。Komissarova等發現不同人提供的淋巴母細胞對亞砷酸鹽的毒性作用具有不同的敏感性，他們通過比較砷敏感的2種淋巴母細胞和砷抗性的兩種淋巴母細胞的基因表達圖譜，發現γ-谷氨酰轉肽酶和人B細胞κ輕肽基因增強子核因子抑制因子ε（Nfkbie）在砷抗性的淋巴母細胞中表達增加，提示γ-谷氨酰轉肽酶和Nfkbie可能可以作為砷遺傳敏感性的生物標記物，并且這一方法同樣適用于別的藥物。
7提高藥物研究的成功率
研究藥物的毒性作用與基因多態性的關系，能提高藥物研究的成功率，減少不必要的藥物淘汰。有些藥物雖然效果很好，但對一部分人不良反應太大而不得不被淘汰。若是研究出該藥對某些基因組患者有效，而對另一些基因組患者無效或有不良反應，然后在用藥前先對患者用基因芯片診斷，就能對一部分患者進行很好的治療，另一部分患者可以改用他藥。這樣該藥就會繼續發揮作用而不必被淘汰。而且利用基因芯片技術進行藥物基因組學的研究，根據遺傳差異對患者分型，從而進行新藥臨床試驗，能夠減少試驗人數而得到統計學結果，從而降低費用和時間。
8結語
在傳統的藥物毒理安全性評價研究中，采用常規動物模型的方法居多，動物選擇范圍有限，以大鼠、比格犬、猴居多，與人的遺傳背景差異較大，不能很好的反映藥物在人體上的作用；而且存在試驗周期長、藥物用量大、容易出現毒性作用假陰性等缺點。隨著分子生物技術水平的發展，藥物毒理學評價研究的方向逐步轉向使用遺傳背景與人更相似的動物，如轉基因動物；在基因水平、分子水平、細胞水平等不同層次研究藥物對機體的影響；對藥物進行早期、高通量的毒理篩選；增加測定指標，重點進行藥物對心、肝、腎等主要器官的毒性早期觀測；尋找人類藥物不良反應的關聯基因及關聯因素等方向，而基因芯片技術的成熟進一步推動了藥物毒理學研究的發展。
目前，利用基因芯片技術檢測藥物的潛在毒性作用、探索藥物毒性作用機制的研究較為廣泛，而利用基因芯片技術進行高通量的新藥毒理篩選、研究混合藥物的毒性機制、毒性作用與基因多態性相關性方面的研究才剛剛起步。隨著基因組學研究的深入，利用基因芯片技術將不同患者進行分群，藥物的毒性作用與特定基因間的關系也將被闡明，根據毒性作用的易感基因開發出用于特定基因人群的藥物并指導臨床患者用藥，將是藥物毒理學研究發展的趨勢。
然而，基因芯片技術還存在不少問題：①費用昂貴：相關儀器、試劑和芯片價格均較高；②背景干擾：在使用全核酸片段進行雜交時，應考慮常見的背景干擾單個被檢核酸變異的問題；③重復性：不同的RNA提取方式會導致結果的不同，這給不同實驗室之間實驗數據的交流帶來困擾，因此每次試驗要求重復2～3次來證實最初的結果，為節約費用，建議用Norfilemblots或liT-PCR技術來驗證；④特異性和敏感性：在信號的獲取與分析上，當前多數方法使用熒光法進行檢測和分析，重復性較好，但靈敏性仍然不高；⑤標準化：在雜交信號的定量分析上，由于標記染料的不同，不同來源的檢測結果在標準化上存在欠缺。盡管基因芯片技術仍存在很多問題，但其發展和應用前景非常廣闊，隨著基因芯片技術的日漸成熟，新藥的安全性評價技術也將更加完善。