鎘汞綜合對雌激素的重要性范文
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作者：王思華陳小玉單位：河南省職業病防治研究院勞動衛生科鄭州大學公共衛生學院毒理學教研室
環境雌激素是較為重要的一類內分泌干擾物，環境雌激素樣物質既具有其自身的化學特性，還具有雌激素樣作用，無論這些物質雌激素樣作用的強弱，都能增加額外的雌激素負荷［1］。當親代暴露于環境雌激素樣物質，不僅對機體自身內分泌、神經、生殖和免疫等多系統造成損害，而且能夠對子代造成不可逆的損害［2－6］，最近幾年引起廣泛關注。汞和鎘廣泛存在于生產和生活環境中，它們對人類和動物的損害作用是否也是通過內分泌干擾作用，而且兩者聯合是否有雌激素樣作用，目前還未有確切證據。本研究采用去卵巢大鼠子宮增重實驗和大鼠子宮內膜增殖實驗探討HgCl2和CdCl2及二者聯合應用的雌激素樣作用，為進一步研究其生殖發育毒性作用機制提供理論依據。
1材料與方法
1．1試劑和儀器
HgCl2，分析純，北京化工廠。CdCl2，分析純，中國亭生化學試劑廠。雌二醇(estradiol，E2)，Sig-ma公司產品。核仁組成區相關嗜銀蛋白(argyro-philicnucleolarorganizerregion-associatedproteins，Ag-NORs)銀染工作液的配制:用體積分數為10%的甲酸配制體積分數為2%的明膠溶液，再將明膠溶液與體積分數為50%的硝酸銀按體積比1∶2混合即成。868045型普通光學顯微鏡(日本Olympus公司)，切片機(湖北徠克醫療儀器有限公司)、電子天平(德國Sartorius公司)。
1．2動物和去卵巢大鼠模型的建立
成年雌性SD大鼠66只，體重210～230g，由河南省實驗動物中心提供，動物許可證號:醫動字第410117號。飼養環境溫度為18～22℃，濕度60%～70%，晝夜周期為12h/12h，普通飼料飼養，自由飲水進食。將性成熟雌性SD大鼠實驗室適應3d后，稱重，剪毛，ip給予2%戊巴比妥鈉2．0ml•kg－1麻醉成功后，腹臥位固定，用碘酊消毒手術區皮膚，沿背中線切開皮膚，切口上端達最后一肋骨處，下端止骶骨。脊柱兩側切開肌層，到達腹腔，取出子宮和卵巢，分離脂肪組織，暴露輸卵管，沿輸卵管處切除卵巢，復位子宮，縫合切口，ip給予慶大霉素1ml，防止動物手術后感染。去卵巢SD大鼠于手術后第3天，每只大鼠行陰道涂片，連續5d，即用棉簽蘸少量生理鹽水，插入陰道內輕輕旋轉兩圈，取出，在玻璃片上涂抹數次，于低倍鏡下觀察白細胞和角化上皮細胞出現情況，判斷卵巢摘除是否完全。連續涂片5d，鏡下均見大量白細胞和少量黏液，未見典型的角化上皮細胞出現判定為卵巢摘除完全;若有大量的典型角化上皮細胞出現，而只有少量的白細胞出現判定為卵巢摘除不完全。
1．3動物分組及給藥
按參考文獻［7］將完全摘除卵巢的大鼠，于術后第8天隨機分為11組，每組6只，分別為去卵巢模型對照組(給予生理鹽水);E20．08mg•kg－1(陽性對照組)，以花生油為溶劑;HgCl20．04，0．20和1．00mg•kg－1組;CdCl20．08，0．40和2．00mg•kg－1組，HgCl2+CdCl2(0．04+0．08)，(0．04+0．40)和(0．04+2．00)mg•kg－1，給藥容積為2．0ml•kg－1，每天ip給予1次，連續3d。
1．4取材和制片
最后一次給藥后24h，稱重，頸椎脫臼處死大鼠，處死前2h每只大鼠ip給予秋水仙堿4mg•kg－1，使細胞分裂停滯于有絲分裂中期。迅速取出子宮，稱質量后，于子宮中段垂直于子宮角長軸朝子宮體方向切取約1cm子宮組織，經Bouin固定液固定，在24h內，用體積分數為70%乙醇洗滌直至苦味酸的黃色消失。常規石蠟包埋，一半切片進行常規HE染色;另一半進行硝酸銀染色。
1．5子宮臟器系數測定
準確稱量子宮質量(g)和體重(g)，子宮臟器系數=子宮質量(g)/體重(g)×100。
1．6有絲分裂指數測定
參照文獻［8］在油鏡下，常規HE染色的每個切片隨機選取10個視野，每個視野計數40個子宮內膜腺體細胞，記錄處于有絲分裂的細胞數，按下式計算有絲分裂指數(mitoticindex，MI)(%)=有絲分裂細胞數/觀察細胞數×100%。每只大鼠觀察2張切片，結果取平均值。
1．7Ag-NORs顆粒數觀察
Ag-NORs顆粒為黑色顆粒，位于核仁中與細胞核內(細胞核背景呈淡黃色)。在油鏡下，每個切片隨機選取10個視野，每個視野計數40個染色均勻、背景清晰的細胞，計數Ag-NORs顆粒數，并計算每個細胞Ag-NORs顆粒數。每只大鼠觀察2張切片，結果取平均值。
1．8統計學分析
子宮臟器系數和有絲分裂指數用x珋±s表示，均數之間的多重比較，采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較采用LSD方法。Ag-NORs顆粒數用中位數表示，組間比較用非參數檢驗進行統計學分析。
2結果
2．1HgCl
2或CdCl2及二者聯合對去卵巢SD大鼠子宮的增重作用表1結果表明，與去卵巢模型對照組比較，HgCl21．00mg•kg－1組、CdCl22．00mg•kg－1組及HgCl2+CdCl2(0．04+0．08)和(0．04+2．00)mg•kg－1組大鼠的子宮臟器系數明顯升高(P＜0．05);與相應劑量CdCl2組比較，HgCl2+CdCl2(0．04+0．08)mg•kg－1組的子宮臟器系數明顯升高(P＜0．05)。
2．2HgCl
2或CdCl2及二者聯合對去卵巢SD大鼠子宮內膜細胞有絲分裂指數的影響表2結果顯示，與去卵巢模型對照組相比，除了CdCl20．08mg•kg－1組外，其余各組大鼠的MI有明顯差異(P＜0．05);與相應劑量CdCl2組比較，HgCl2+CdCl2(0．04+0．08)和(0．04+0．40)mg•kg－1的MI值明顯增高(P＜0．05)。
2．3HgCl
2或CdCl2及二者聯合對去卵巢SD大鼠子宮內膜細胞Ag-NORs顆粒數的影響表3結果顯示，與去卵巢模型對照組相比，HgCl21．00mg•kg－1組、CdCl22．00mg•kg－1組及HgCl2+CdCl2(0．04+0．08)和(0．04+2．00)mg•kg－1組的去卵巢大鼠子宮內膜Ag-NORs顆粒數有明顯增高(P＜0．05);與相應劑量的CdCl2組比較，僅HgCl2+CdCl2(0．04+0．08)mg•kg－1組的差異具有統計學意義(P＜0．05)。
3討論
子宮增重實驗是最早建立的檢測雌激素活性的經典方法，目前仍被廣泛應用。大鼠去卵巢后，當給予其雌激素樣物質后，能誘導靶細胞增殖與分化，表現為子宮重量增加，測定子宮重量或子宮臟器系數，就能夠反映雌激素活性和強度［9－10］。在去卵巢SD雌性大鼠子宮增重實驗中，陽性對照雌二醇組子宮臟器系數明顯高于去卵巢模型對照組。HgCl2組和CdCl2組子宮臟器系數呈劑量-效應關系，但經單因素方差分析，僅高劑量組與去卵巢模型對照組相比，有顯著差異(P＜0．05)，與申立軍等［7］和Hfer等［11］研究結果一致，進一步證明了HgCl2和CdCl2在高劑量時具有雌激素活性。Soto等［12］亦認為子宮增重實驗所采用的子宮重量變化等指標的敏感性不夠。為此，本研究選用去卵巢大鼠子宮內膜增殖實驗，根據MI的變化來判斷細胞的增殖速率、細胞周期和有絲分裂時間［8］。本研究結果顯示，與去卵巢模型對照組相比，除HgCl20．04mg•kg－1組外，HgCl2和CdCl2各劑量組MI均明顯增加，且隨著染毒劑量的增加而遞增(P＜0．05)。此實驗結果佐證了HgCl2和CdCl2具有雌激素活性。
核仁組成區(nuclearorganizerregion，NOR)具有嗜銀性，因此可以用膠體銀染色技術加以檢測。Ag-NORs是被硝酸銀染色的NOR區，由某些染色體上聚集的蛋白質組成［13］(即具有轉錄活性的r-DNA區域周圍的酸性非組蛋白(B23蛋白和C23蛋白))，主要生物學功能為參與調控核糖體前RNA的轉錄、加工和裝配或調節RNA聚合酶Ⅰ亞單位，起維持RNA鏈伸展的作用，可以反映核仁結構與功能的變化，還可以作為細胞r-DNA轉錄活性的標志物［14］，是反映細胞增殖的良好指標。本研究通過Ag-NORs這個敏感指標，觀察HgCl2與CdCl2的雌激素活性。結果表明，HgCl2和CdCl2各劑量組Ag-NORs呈劑量-效應關系;與去卵巢模型對照組相比，高劑量HgCl2組和CdCl2組Ag-NORs有明顯差異(P＜0．05)，亦佐證了HgCl2和CdCl2在高劑量時具有雌激素活性。去卵巢SD大鼠子宮增重實驗和Ag-NORs顆粒數實驗中，HgCl20．04和0．20mg•kg－1未表現出雌激素活性，CdCl20．08和0．40mg•kg－1亦未表現出雌激素活性。
HgCl20．04mg•kg－1和CdCl20．08mg•kg－1均不能提高去卵巢SD雌性大鼠子宮臟器系數，但二者聯合作用后，能夠提高去卵巢SD雌性大鼠子宮臟器系數，與去卵巢模型對照組和CdCl2相應劑量組相比差異顯著(P＜0．05)，說明二者聯合具有雌激素活性，提示二者能夠產生聯合效應。未顯示雌激素活性劑量的HgCl2與各劑量CdCl2混合后的子宮臟器系數均比相應劑量CdCl2組的子宮臟器系數增加，說明低劑量HgCl2能夠提高CdCl2各劑量組雌激素活性，尤其(HgCl2+CdCl2)低劑量組與相應劑量CdCl2組相比，差異有統計學意義(P＜0．05)，說明未顯示雌激素活性劑量的HgCl2可使不顯示激素活性劑量CdCl2顯示雌激素活性。二者之間能夠產生聯合作用，可能與HgCl2和CdCl2同為二價重金屬，具有相似的作用機制和靶位點有關。
去卵巢子宮內膜細胞增殖實驗亦表明，HgCl20．04mg•kg－1能夠明顯提高CdCl2各劑量組MI值(P＜0．05)。與相應劑量的CdCl2組比較，中、低劑量組的有明顯差異(P＜0．05)，說明HgCl2能夠增強CdCl2的雌激素活性，使原本未顯示雌激素活性劑量的CdCl2表現有雌激素活性，而高劑量CdCl2雌激素活性增加不明顯，但仍具有明顯的雌激素活性。
HgCl20．04mg•kg－1能夠提高CdCl2各劑量組Ag-NORs顆粒數，與相應的CdCl2組比較，僅低劑量組的差異具有統計學意義(P＜0．05);但與去卵巢模型對照組相比，高、低劑量組有明顯差異(P＜0．05)。同樣說明了低劑量HgCl2能夠增強CdCl2的雌激素活性，使原本未顯示雌激素活性劑量的CdCl2表現有雌激素活性劑量。本研究中，子宮增重實驗、子宮內膜細胞有絲分裂指數和子宮內膜細胞Ag-NORs顆粒數三項指標結果均能證明未顯示雌激素活性劑量的HgCl2可使不顯示激素活性劑量CdCl2顯示雌激素活性，說明了二者有聯合作用。但上述三項結果均為HgCl2+CdCl2(0．04+0．40)mg•kg－1最低，可能由于樣本量小，需要進一步的實驗研究。
本研究提示環境雌激素之間能夠產生聯合作用，特別是低劑量時聯合作用更加明顯，即使是以未顯示雌激素活性的劑量混合，仍然能夠顯示出雌激素活性。事實上，在環境中HgCl2和CdCl2多以較低濃度混合存在，如單獨研究其中一種物質在較低劑量時的雌激素樣作用，往往會發現它們對生物體幾乎不產生任何損害作用。人類在生活、生產中，往往同時或相繼接觸二者，當以無雌激素樣作用劑量或低雌激素樣作用劑量混合進入機體后，一部分經代謝排出，但大部分能夠在體內蓄積，產生聯合作用。另外，HgCl2和CdCl2具有不易降解、殘存期長等特點，因而應廣泛關注其危害。
