RNA檢驗(yàn)法對(duì)法醫(yī)學(xué)的作用范文

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本文作者：李中紅洪一蘭李紅霞劉秋英單位：廣州市公安局刑事技術(shù)所中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院廣東珠海暨南大學(xué)生物醫(yī)藥研究開(kāi)發(fā)基地廣東廣州

隨著分子生物學(xué)技術(shù)方法的成熟與發(fā)展，DNA分析技術(shù)已經(jīng)在法醫(yī)學(xué)中得到廣泛應(yīng)用，但rna技術(shù)的應(yīng)用還處于起步階段。法醫(yī)學(xué)中采用RNA分析判斷死亡間隔時(shí)間的第一篇文獻(xiàn)在1984年發(fā)表，隨后也只有一些零散的報(bào)導(dǎo)，直到上個(gè)世紀(jì)末期，RT-PCR技術(shù)的發(fā)展促使了RNA在體液分析中的應(yīng)用和傷口愈合中分子變化的研究。最近幾年RNA技術(shù)在法醫(yī)病理分子生物學(xué)中的研究及應(yīng)用越來(lái)越多，國(guó)際期刊有關(guān)RNA技術(shù)在法醫(yī)學(xué)研究中的文章逐步增加，但我國(guó)有關(guān)RNA技術(shù)在法醫(yī)病理學(xué)中研究的報(bào)道甚少。本文綜述了近年的研究中，RNA技術(shù)在法醫(yī)病理學(xué)中的應(yīng)用研究的幾個(gè)方面。

1死亡后RNA穩(wěn)定性

人死亡后RNA將被核糖核酸酶所降解，物理的和化學(xué)的因素還會(huì)加速這個(gè)降解的過(guò)程。在核糖核酸酶富集的器官（如胰腺和肝臟等）RNA斷裂降解的速度較快，而在其他組織（如大腦等）則在死亡后RNA降解很慢，間隔96h后RNA還比較穩(wěn)定。在胎兒和新生的肺組織、人骨頭和血液中死亡后的RNA的穩(wěn)定時(shí)間也比較長(zhǎng)。針對(duì)人體的研究表明，盡管在死亡后總RNA已經(jīng)有所降解，但在死亡間隔時(shí)間超過(guò)96h的樣品中提取的mRNA適用于進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。研究已證實(shí)在大鼠的腦組織中可以獲得最穩(wěn)定的mRNA，而在肝臟組織中RNA的降解最嚴(yán)重[4]。盡管一些研究認(rèn)為死亡后大腦組織中的RNA降解不多，但死亡前的昏迷或窒息等痛苦因素也會(huì)影響死亡后人腦中的RNA的穩(wěn)定性。在另一方面，如果死亡前的痛苦因素確實(shí)影響到死亡后mRNA完整性和/或死亡前基因表達(dá)的話，那么通過(guò)mRNA分析可以判斷死亡前的痛苦因素，鑒別死亡前的痛苦類型和持續(xù)時(shí)間，昏迷的時(shí)間及程度等，這些對(duì)于分析死亡信息很有用[5]。

2體液類型的鑒定

DNA分析可以從一個(gè)小污點(diǎn)痕跡中取得一些細(xì)胞就可以進(jìn)行，但是無(wú)法鑒定到這個(gè)細(xì)胞的來(lái)源，例如收集到體液可以進(jìn)行個(gè)體鑒別，但PCR分析有時(shí)無(wú)法鑒定是某種體液。因?yàn)樵诓煌捏w液中細(xì)胞和組織功能不一樣，mRNA表達(dá)水平不一樣，所以通過(guò)檢測(cè)mRNA的表達(dá)可以對(duì)體液類型進(jìn)行鑒別[6-8]?；|(zhì)金屬蛋白酶-11是一種能降解細(xì)胞外基質(zhì)的水解蛋白酶，該酶在月經(jīng)血中表達(dá)的特異性高，因此通過(guò)檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-11的mRNA的表達(dá)，可以成為對(duì)月經(jīng)血區(qū)別于其他血液的標(biāo)志物[9]。痕量血跡已成為重要的證據(jù)類別，月經(jīng)血的鑒定是重要的體液檢測(cè)[10]。一般的血液中則是β-膜收縮蛋白（β-Spectrin，SPTB）、膽色素原脫氨酶（Porphobilinogen-Deami-nase，PBGD）和α-血紅蛋白1（Hemoglobinalphalocus1,HBA）表達(dá)高。另外，精液和唾液等體液的特異性標(biāo)志物的研究發(fā)現(xiàn)也會(huì)對(duì)法醫(yī)鑒定具有重要的意義。唾液中富酪蛋白（Statherin，STATH）的表達(dá)較高。精蛋白1(Protamine1，PRM1)、精蛋白2(Protamine2，PRM2)、激肽釋放酶3(Kallikrein3，KLK=PSA)是精液的特異性標(biāo)志物。人β防御素1(Humanbeta-defensin1，HBD-1)和粘液素4(Mucin4)。

3損傷時(shí)間的鑒定

法醫(yī)學(xué)中通常需要對(duì)一種內(nèi)傷或外傷的受傷時(shí)間進(jìn)行鑒定，包括推斷受傷先后順序，損傷發(fā)生在死亡前還是死亡后，受傷與死亡的時(shí)間間隔，傷害是否是導(dǎo)致死亡的原因等。近年的研究發(fā)現(xiàn)可通過(guò)研究受傷害部位及其附近組織的分子變化可以解決這些問(wèn)題，主要研究焦點(diǎn)就是通過(guò)RNA技術(shù)進(jìn)行鑒定[5,11]。在細(xì)胞功能進(jìn)行改變的時(shí)候總包括有基因表達(dá)的變化，一種新蛋白的合成或者某一種蛋白濃度的增加首先需要該蛋白的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，也就是需要集聚大量的mRNA與核糖體相結(jié)合，所以mRNA水平顯著提高?？偠灾?，在受傷后細(xì)胞中某一種蛋白合成的改變首先就是該蛋白mRNA合成水平的改變，因此，在法醫(yī)病理學(xué)中，可以通過(guò)對(duì)某蛋白的mRNA進(jìn)行定量分析，得知該蛋白表達(dá)的變化。當(dāng)然，這當(dāng)中關(guān)鍵的還是損傷的檢測(cè)標(biāo)志物的確定，至今為止，僅有少數(shù)的動(dòng)物組織中發(fā)現(xiàn)一些分析受傷時(shí)間的標(biāo)志物，研究發(fā)現(xiàn)腦部受傷后bFGF在受傷后48h達(dá)到表達(dá)的峰值，受傷后1h白介素10的表達(dá)達(dá)到峰值[12]，隨著研究的深入，將來(lái)可以發(fā)現(xiàn)受傷后一系列細(xì)胞因子表達(dá)的變化，并可以找到合適的標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，以確定受傷時(shí)間。Ikematsu等[13]研究發(fā)現(xiàn)在頸部被掐或在機(jī)械外力重傷死亡后30min內(nèi)，通過(guò)熒光差異PCR發(fā)現(xiàn)了一系列的基因表達(dá)發(fā)生了改變。

4死亡間隔時(shí)間的確定

一些研究者提出了采用核酸降解的程度來(lái)檢測(cè)死亡間隔時(shí)間[14]，某些基因RNA的降解程度與死亡間隔時(shí)間呈現(xiàn)一定的規(guī)律，通過(guò)RNA降解程度或者RT-PCR檢測(cè)可以推斷死亡間隔時(shí)間。一些研究發(fā)現(xiàn)在一定的環(huán)境條件下，死亡后24-48h內(nèi)，尸體的RNA還保持很好的完整性。劉良等[15]研究發(fā)現(xiàn)大鼠死后管家基因GAPDH、β-actinmRNA具有一定的穩(wěn)定性，大鼠死后不同組織、不同管家基因mRNA的穩(wěn)定性(即檢測(cè)時(shí)限)不同：對(duì)于GAPDH，腦為7d、肝為48h、脾為32h、腎為40h；對(duì)于β-actin，腦為8d、肝為72h、脾為40h、腎為48h。與GAPDHmRNA相比，β-actinmRNA更不易降解。采用一步法熒光標(biāo)記RT-PCR技術(shù)檢測(cè)大鼠死后不同組織(腦、肝、脾、腎)管家基因GAPDH及β-actinmRNA的降解規(guī)律，可為死亡間隔時(shí)間的推斷研究提供一種新的、客觀、有效的觀測(cè)指標(biāo)，可為常規(guī)死亡間隔時(shí)間推斷方法的補(bǔ)充。因此，通過(guò)檢測(cè)RNA的降解提供有關(guān)RNA在組織中的完整性等信息，可以應(yīng)用于受傷時(shí)間或者死亡時(shí)間等的判斷。

5痕量血液的殘留時(shí)間鑒別

采用基于RT-PCR技術(shù)的特殊的多重RT-PCR和競(jìng)爭(zhēng)RT-PCR技術(shù)等，Bauer等[6]和Anderson等[16]從干燥的血液痕跡中取材檢測(cè)了RNA降解參數(shù)，對(duì)材料的殘留時(shí)間進(jìn)行判斷。即使材料完全干燥了，但是體外的RNA降解過(guò)程仍然繼續(xù)，同時(shí)這個(gè)過(guò)程也是很緩慢并且有很多變數(shù)的。隨著技術(shù)的發(fā)展，將來(lái)通過(guò)采用實(shí)時(shí)定量PCR和芯片掃描技術(shù)可以提供更靈敏的方法進(jìn)行鑒定。

6死亡瞬間細(xì)胞或器官功能狀態(tài)的檢測(cè)

法醫(yī)學(xué)的重要研究就是死亡原因的鑒定，在瞬間死亡的過(guò)程中細(xì)胞和器官的功能改變比疾病發(fā)生過(guò)程中的改變要快速。然而，很多死亡并不會(huì)產(chǎn)生形態(tài)學(xué)的改變，因?yàn)榭赡苓@些改變并沒(méi)有持續(xù)很久，沒(méi)有時(shí)間使機(jī)體產(chǎn)生可視的變化。另一方面，細(xì)胞功能的變化首先表現(xiàn)在mRNA模式--分析這個(gè)死亡后樣品可以為分析導(dǎo)致死亡的病理學(xué)機(jī)制，mRNA可以快速地在幾分鐘內(nèi)上調(diào)，可以在緊急發(fā)生的時(shí)間得到檢測(cè)。

最近對(duì)紅細(xì)胞生成素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、缺氧誘導(dǎo)因子1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的研究發(fā)現(xiàn)，這些因子受到供氧的調(diào)控[17,18]，因此檢測(cè)這些因子的mRNA水平的定量分析可以反應(yīng)死亡時(shí)的供氧情況。理論上，采用芯片掃描技術(shù)，可以一次實(shí)驗(yàn)分析得到多種基因表達(dá)水平的結(jié)果，從而有利于對(duì)死亡原因進(jìn)行深入的分析。分子改變例如可誘導(dǎo)NO的含量增加在腦組織中伴隨著急性酒精中毒，這有助于判斷死亡原因。受到壓力沖擊導(dǎo)致的分子變化前面已經(jīng)描述過(guò)了。神經(jīng)受傷促使了FE65（一種β淀粉前體蛋白結(jié)合蛋白）等一些分子標(biāo)志物的改變[19]，如果是受到外物的擊傷，則在肺組織中一些細(xì)胞因子的表達(dá)會(huì)發(fā)生改變。

在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，對(duì)于死亡后組織中RNA變化的應(yīng)用研究剛起步，但目前的科研發(fā)展和研究進(jìn)展來(lái)看，在這方面的應(yīng)用將是不久將來(lái)的事情。隨著分子生物學(xué)技術(shù)方法的發(fā)展與成熟，RNA技術(shù)在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用也將逐步完善和推廣。