香芹酚處理癌細(xì)胞論文范文

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1材料與方法

1．1流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡取對數(shù)生長期BGC-823細(xì)胞以5×105•ml－1接種于6孔板中，分為對照組、香芹酚處理組，每組設(shè)3個復(fù)孔，加藥48h后，收集各組細(xì)胞，PBS洗2次，離心棄上清，懸于結(jié)合緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106•ml－1。加5μlAnnexinV-FITC和PI混勻液，避光室溫孵育10min。用結(jié)合緩沖液洗1次后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。AnnexinV(－)PI(－)為活細(xì)胞，AnnexinV(－)PI(+)為機(jī)械損傷細(xì)胞，AnnexinV(+)PI(－)為早期凋亡細(xì)胞，AnnexinV(+)PI(+)為晚期凋亡細(xì)胞，實驗中以AnnexinV(+)作為凋亡細(xì)胞［8］。

1．2Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell上室內(nèi)膜。無血清細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整BGC-823細(xì)胞密度，按5×103•ml－1的密度接種上室，同時加入終濃度為80μmol•L－1的香芹酚，下室加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于48h后取出上室，4%甲醛固定15min，晾干后結(jié)晶紫染液染色5min，倒置顯微鏡下觀察拍照。33%冰醋酸洗凈結(jié)晶紫，收集洗脫液酶標(biāo)儀檢測(A573nm)［9］。

1．3QuantitativeRealtime-PCR檢測MMP-9、TIMP-1mRNA的表達(dá)80μmol•L－1香芹酚處理48h的BGC-823細(xì)胞作為實驗組;未處理的BGC-823細(xì)胞作為對照組。按Trizol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，電泳鑒定并定量后，依據(jù)Takara公司逆轉(zhuǎn)錄說明書將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，實時熒光定量PCR反應(yīng):SYBR反應(yīng)體系共25μl，反應(yīng)條件:95℃2min，95℃10s，60℃30s，40個循環(huán)，溶解曲線95℃2min，95℃15s，60℃1min，95℃15s。以2-ΔΔCt表示計算目的基因mRNA的相對表達(dá)量，每組重復(fù)3次取平均值。所檢測的目的基因和內(nèi)參基因的相關(guān)引物設(shè)計合成由上海生工生物工程有限公司完成，引物序列見表1。

1．4Westernblot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。取各組總蛋白40μg進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1h，一抗4℃孵育過夜。加入1∶5000倍稀釋二抗，37℃孵育1h，ECL法進(jìn)行底物發(fā)光，曝光成像后掃膜分析。

1．5統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS18．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)以x珋±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1香芹酚對胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)MTT檢測結(jié)果顯示，不同濃度香芹酚處理細(xì)胞24h、48h、72h后，能夠顯著抑制胃癌BGC-823細(xì)胞的生長，香芹酚處理組與陰性對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)，并且抑制效應(yīng)呈濃度、時間依賴性，結(jié)果如圖1所示。根據(jù)香芹酚對胃癌BGC-823細(xì)胞的生長抑制率計算出其作用48h的IC50分別為78．6μmol•L－1。

2．2香芹酚對胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡的影響香芹酚處理胃癌BGC-823細(xì)胞48h后，使用AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測，結(jié)果如圖2所示，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡率也相應(yīng)增加，呈劑量效應(yīng)關(guān)系，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(細(xì)胞凋亡率:0μmol•L－1vs10μmol•L－1，0μmol•L－1vs20μmol•L－1，0μmol•L－1vs40μmol•L－1，0μmol•L－1vs80μmol•L－1;P均＜0．0001)，結(jié)果表明香芹酚能夠有效誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡。

2．3香芹酚對胃癌BGC-823細(xì)胞侵襲的影響80μmol•L－1香芹酚處理胃癌BGC-823細(xì)胞48h后，使用Matrigel-transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果如圖3所示。同對照組相比，香芹酚處理組胃癌BGC-823細(xì)胞侵襲能力明顯降低(0μmol•L－1vs80μmol•L－1，P＜0．0001)，結(jié)果表明香芹酚能夠降低胃癌細(xì)胞細(xì)胞的侵襲能力。

2．4香芹酚對胃癌BGC-823細(xì)胞PARP、Caspase-9表達(dá)的影響香芹酚處理胃癌BGC-823細(xì)胞48h后，使用Westernblot檢測香芹酚對細(xì)胞PARP、caspase-9表達(dá)的影響，結(jié)果如圖4所示。同對照組相比，香芹酚處理組胃癌BGC-823細(xì)胞出現(xiàn)PARP裂解片段且caspase-9的表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．0001)。

2．5香芹酚對胃癌BGC-823細(xì)胞MMP-9、TIMP-1表達(dá)的影響香芹酚處理胃癌BGC-823細(xì)胞48h后，使用實時熒光定量PCR檢測香芹酚對細(xì)胞MMP-9、TIMP-1mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果如圖5所示，香芹酚處理組細(xì)胞MMP-9的表達(dá)明顯降低，而TIMP-1的表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．0001)。

2．6香芹酚對胃癌BGC-823細(xì)胞MAPK信號通路的影響香芹酚處理胃癌BGC-823細(xì)胞48h后，使用Westernblot檢測香芹酚對細(xì)胞ERK、P38的激活情況，結(jié)果如圖6所示，各組總ERK以及總P38的表達(dá)均無明顯變化(P＞0．05)，香芹酚作用后磷酸化ERK表達(dá)有所降低，而磷酸化P38的表達(dá)有所升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．0001或0．01)，結(jié)果表明香芹酚抑制了ERK的激活同時促進(jìn)了P38的激活。

3討論

香芹酚化學(xué)名稱5-異丙基-2-甲基苯酚，又名異麝香草酚，是牛至油以及百里香油的主要成分，為一種安全的食品添加劑，常應(yīng)用于糖果、飲料和口香糖的生產(chǎn)中［9］。研究表明，香芹酚有著廣泛的生物活性，如抗炎、抗氧化以及抗腫瘤等效應(yīng)。Aru-nasree［6］研究發(fā)現(xiàn)香芹酚作用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB231后，乳腺癌細(xì)胞的增殖能力明顯降低，且凋亡明顯增加，推測其可能通過增加線粒體釋放細(xì)胞色素C以及激活caspase等所致。Koparal等研究表明香芹酚作用于非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549后，細(xì)胞增殖能力呈劑量依賴性的降低，同時DNA斷裂，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，表明香芹酚對肺癌具有細(xì)胞毒性作用。Yin等將不同濃度的香芹酚作用于肝癌細(xì)胞株HepG2，結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞增殖受到抑制且凋亡細(xì)胞明顯增加。本研究利用香芹酚處理胃癌細(xì)胞，結(jié)果顯示胃癌BGC-823細(xì)胞增殖活性明顯受到抑制，凋亡明顯增加且侵襲能力降低，表明香芹酚具有一定的抗胃癌作用。

細(xì)胞內(nèi)的一系列凋亡級聯(lián)反應(yīng)中均有caspase的參與，其中caspase-9為凋亡級聯(lián)反應(yīng)下游重要的效應(yīng)酶。PRAP在維持DNA完整性上發(fā)揮著重要作用并被作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)志。若PRAP發(fā)生降解則失去對DNA完整性的保護(hù)作用，使核酸內(nèi)切酶活性增高，裂解核小體間的DNA，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。本研究中香芹酚作用后胃癌細(xì)胞中PRAP出現(xiàn)了裂解的片段，且caspase-9表達(dá)升高，結(jié)果表明香芹酚能夠有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡活性。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信號通路主要包括ERK、P38以及JNK三條通路，其在細(xì)胞增殖、凋亡以及分化過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，腫瘤組織中ERK通路常處于異常的激活狀態(tài)，P38信號則參與多種細(xì)胞凋亡途徑，P38的激活能夠誘導(dǎo)c-Myc、p53以及Fas/FasL等多種凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)凋亡。ERK通路的激活能夠抑制細(xì)胞的凋亡，而抑制ERK信號通路能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。近期研究顯示香芹酚作用于肝癌細(xì)胞后，磷酸化ERK的表達(dá)顯著降低，而磷酸化P38顯著升高，但JNK未發(fā)生明顯變化，本研究將香芹酚作用胃癌細(xì)胞后同樣檢測到ERK活性的降低，P38活性的升高，表明香芹酚誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的過程可能與ERK及P38信號通路相關(guān)。

胃癌易發(fā)生轉(zhuǎn)移且目前尚無有效的治療手段。腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移為一個多步驟的生物學(xué)過程，其中細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解是腫瘤的轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及其抑制劑(TIMPs)在此過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［19］。香芹酚處理組組細(xì)胞侵襲能力顯著降低同時MMP-9表達(dá)受到抑制而TIMP-1表達(dá)升高，提示香芹酚在抑制胃癌細(xì)胞侵襲的過程中也發(fā)揮著一定的作用。ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與MMPs表達(dá)的調(diào)節(jié)，抑制ERK的激活能夠阻礙腫瘤的侵襲［20］，由此推測香芹酚抑制胃癌侵襲的作用可能與ERK通路的抑制有關(guān)，但此過程是否還有其他通路的參與及其詳細(xì)的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

作者：孫時華姜榮華祝海燕姜建軍單位：江山市中醫(yī)院浙江省衢州市人民醫(yī)院浙江省江山市人民醫(yī)院